从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离脂肪来源的干细胞

摘要

来源：Qi, Y.，等。从主动脉周围脂肪组织中分离、培养及诱导神经嵴来源的脂肪干细胞向脂肪细胞分化。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种从小鼠主动脉弓周围脂肪组织中分离和培养荧光标记的神经嵴来源脂肪干细胞（ADSCs）的技术。分离后，通过荧光激活细胞分选技术检测并分选NCADSCs，随后将其接种于培养板中进行培养，以促进细胞增殖。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 基质血管组分（SVF）的分离

将5-6只小鼠的主动脉弓周围脂肪组织（PAAT）收集到一个含有1 mL新鲜配制消化液的2 mL微量离心管中，在室温（RT）下用手术剪在Eppendorf管中剪碎组织。

1. 将混合物转移至含有9 mL消化液的50 mL离心管中。用1 mL移液器上下吹打10次，以充分匀浆组织。
2. 将离心管在37 °C、100 rpm恒定振荡条件下孵育30–45分钟，并每隔5–10分钟检查一次，以防止过度消化。这一步骤对提高细胞活力和得率至关重要。
   注意：良好的组织消化结果应呈现均匀的浅黄色脂肪组织，轻轻摇动离心管时肉眼可见。
3. 加入5 mL含10% FBS和1% v/v PS的HDMEM（室温），通过移液充分混匀以终止消化。
4. 将细胞悬液在室温下以500 × g离心5分钟。基质血管组分（SVF）将形成棕褐色沉淀。小心吸除漂浮的脂肪细胞，并倾倒剩余上清液，注意不要扰动SVF沉淀。将SVF沉淀溶解于10 mL培养基中，经70 µm细胞滤网过滤。
5. 再次以500 × g在室温下离心5分钟，弃去上清液，将沉淀轻轻重悬于15 mL锥形管中的5 mL红细胞裂解缓冲液中，室温孵育10分钟。
6. 加入10 mL含1% FBS的1× PBS终止反应。将细胞悬液在4 °C下以500 × g离心5分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于10 mL含1% FBS的1× PBS中。
7. 再次在4 °C下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀在4 °C下重悬于15 mL锥形管中的5 mL培养基中。
8. 经过最后一次离心（4 °C，500 × g，5分钟）后，将沉淀细胞重悬于冰上预冷的5 mL FACS缓冲液（含10% FBS、100单位/mL DNA酶I和1% v/v PS的PBS）中，并用血细胞计数板进行细胞计数。

2. 通过流式细胞术分离神经嵴来源的干细胞

1. 根据说明书设置并优化细胞分选仪。选择100 µm喷嘴，对收集管进行灭菌，安装所需的收集装置，并设置侧流系统。
2. 分选RFP+细胞时，建议使用561 nm黄色/绿色激光器和579/16光学滤光片。使用阴性对照和单染阳性对照进行补偿调节。分选门控策略见图1A。
3. 将细胞通过40 µm滤网过滤，以500 x g离心5分钟，并重悬于2 mL FACS缓冲液中，细胞密度为0.5–1 x 10⁷/mL。将细胞转移至明确标记的5 mL圆底聚苯乙烯管中，并装入分选仪。
4. 在4 °C条件下运行实验样本管，打开偏转板，将细胞分选至预先加入含1% FBS和1% v/v PS的RPMI培养基的15 mL锥形管中。
   注意：避免强光照射样本，以尽量减少RFP荧光淬灭。

3. NCADSCs 的培养

1. 以每平方厘米5,000个细胞的密度接种分选后的细胞² 在12孔培养板中，加入完全培养基，于37 °C、5% CO₂的湿润环境中培养₂ 20–24 小时。
2. 移除培养基，用预热（37 °C）的PBS洗涤细胞以去除细胞碎片，然后加入新鲜培养基。

结果

图1：源自PAAT的NCADSCs的脂肪向分化。（A）用于表征和分选NCADSCs（RFP）群体的通用设门策略。（B）荧光显微镜图像显示，NCADSCs在12孔培养板上接种96小时后贴壁并扩增。（C–G）代表性图像显示，经脂肪生成诱导后，来自PAAT的NCADSCs经油红O染色呈阳性。（C）对照组（无诱导）。（D）初级NCADSCs和（E）经3次传代的NCADSCs在白色脂肪生成诱导10天后的结果。（F）初级N...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BSA	VWR life sciences	0332-100G	工作浓度50 mg/mL；批号：0536C008
胶原酶 I 型	Gibco	17018029
红细胞裂解缓冲液	Invitrogen	00-4333
FBS	Corning	R35-076-CV	工作浓度50 mg/mL；批号：R2040212FBS
HBSS	Gibco	14025092
HDMEM	Gelifesciences	SH30243.01	批号：AD20813268
PBS（磷酸盐缓冲液）	ABCONE (中国)	P41970
青霉素-链霉素	Gibco	15140122