从小鼠黏膜下层和固有层分离肠胶质细胞

摘要

来源：Wang, Z. 等，从小鼠成年肠壁的黏膜下层和固有层中分离肠胶质细胞。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了一种从小鼠肠道的黏膜下层和固有层中分离肠胶质细胞的方法。该方法概述了提取黏膜下层和固有层组织、从中分离肠胶质细胞，并将细胞接种于包被的培养板中建立肠胶质细胞培养体系的操作步骤。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 无菌聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白溶液的制备

1. 在细胞分离前至少一天，准备好多聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白（laminin）包被的培养板。
   注意： 根据实验目的不同，可分别准备6孔板和12孔板。通常，12孔板用于蛋白质印迹法（western blots）的定量分析，而6孔板用于盛放已高压灭菌（无菌）的盖玻片，以用于免疫组织化学实验。24孔板则用于培养肠胶质细胞（EGCs），以便进行Ca²⁺通量成像。
2. 在配备HEPA过滤空气的组织培养超净台中，使用超纯组织培养级、无DNase和无RNase的水稀释储存液。
3. 玻璃盖玻片的灭菌
   1. 用无菌镊子夹取盖玻片，将其浸入盛有100%乙醇的烧杯中，浸泡15分钟。随后在组织培养超净台中让乙醇自然挥发，再将盖玻片放入6孔板中。
   2. 或者，将若干盖玻片分别单独放置于塑料容器内的2 mm厚吸水纸上，然后进行高压灭菌。

2. 包被板

注意：这些步骤需在无菌的组织培养超净工作台内进行。

1. 解冻1 mg/mL的PDL储备液，并用无菌的组织培养级水按1:10稀释，使终浓度为100 µg/mL。每孔6孔板使用2 mL，每孔12孔板使用1 mL，每孔24孔板使用0.5 mL进行包被。将剩余的稀释PDL分装为12 mL等份，于-20 °C保存。
2. 让PDL在孔板中包被至少1小时后，用无菌移液器吸除PDL溶液。在组织培养超净台中让孔板完全自然晾干。
   注意：用无菌移液器吸出的PDL溶液，经0.22 µm滤器过滤并保存于4 °C后，可在1周内再使用两次。
3. 将层粘连蛋白（laminin）储备液置于冰上解冻，以避免凝胶形成。
   注意：未稀释的层粘连蛋白在温度高于8 °C时会凝固。
4. 用无菌的Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS）将层粘连蛋白储备液（0.5 mg/mL）按1:50稀释，获得终浓度为10 µg/mL的溶液。将稀释后的层粘连蛋白分装为12 mL等份，于-20 °C保存。
5. 将稀释后的层粘连蛋白加入已干燥PDL的孔中。每孔6孔板使用1 mL覆盖表面，每孔12孔板使用0.5 mL。对于盖玻片，每片加入400 µL稀释的层粘连蛋白以实现表面覆盖。
6. 若当天使用，则将包被后的孔板在37 °C孵育2小时（快速包被）。若非当天使用，则用封口膜密封孔板，于4 °C过夜保存（慢速包被）。
   注意：密封至关重要，以防止干燥和污染。
7. 小心用移液器吸除层粘连蛋白溶液，避免刮伤表面。用无菌DPBS轻轻洗涤孔板三次。
8. 向每孔加入完全胶质细胞生长培养基，并将孔板维持在37 °C，直至准备加入EGC悬液。
   注意：聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白包被的孔板可在4 °C保存3天。可提前数天包被孔板，随后于4 °C保存；使用前用无菌Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤三次。最后一次洗涤后，每孔加入2 mL无菌DPBS。用封口膜密封孔板并储存于4 °C。必须确保层粘连蛋白不发生干燥。

3. 分离溶液的制备

1. 制备EDTA/HEPES/DPBS解离溶液。配制500 mL该溶液时，使用无钙镁的无菌DPBS，配制成终浓度为10 mM HEPES和5 mM EDTA的溶液。向490 mL DPBS中加入5 mL 1 M HEPES缓冲液和5 mL 0.5 M EDTA储备液。4 °C保存，备用。
2. 使用表1中所列试剂配制胶质细胞重悬培养基。
3. 使用表2中所列试剂配制胶质细胞生长培养基。
   注意：含GDNF的胶质细胞生长培养基可在4 °C保存一周。

4. 肠段的切除

注意：小鼠在使用异氟烷滴定法实施安乐死后，通过摘除重要器官获取样本，在此之前可自由进食和饮水。实验使用8周龄以上C57BL/6小鼠，两种性别均被采用，且在制备过程中未观察到明显差异。

1. 使用过量异氟烷处死小鼠，并将其仰卧置于解剖托盘中。固定四肢，用70%乙醇对腹部进行消毒。用镊子提起皮肤，然后用剪刀切开腹腔。
2. 提起肝脏，辨认远端胃/幽门。随后，切除近端7 cm的肠段。注意避免撕裂肠道。
3. 用镊子夹住幽门，剪除肠系膜。
   1. 使用剪刀背面进行钝性分离，刮除附着的胰腺组织。
   2. 将肠段放入不含Ca²⁺或Mg²⁺的冰冻DPBS中（图1A）。
      注意：其他肠段或结肠段也可采用相同技术切除。
4. 将5 mL或10 mL注射器连接至钝头20 G针头，用冰冻DPBS冲洗肠腔内容物（图1B）。
5. 将肠段切成3 cm长的小段，以去除纵行肌。 注意：每30 mL HEPES/EDTA/DPBS分离溶液使用最多两只小鼠的肠段。
6. 折断约4 cm长的棉签木棒部分，使木棒与棉头分离。将木棒浸入DPBS中（图1C）。
7. 将一段肠组织平滑地套在湿润的木棒上（图2A-C）。
8. 使用尖头镊子去除仍附着的肠系膜组织（图2D）。
9. 使用干净的刀片或手术刀，在肠段原肠系膜附着处纵向切开两道小切口（图2E）。
   1. 用DPBS润湿棉头。沿肌肉纵向摩擦湿润的棉头，以松解纵行肌/肌间神经丛（LMMP）。在去除LMMP过程中，再将棉头横向移动，逐步分离LMMP与环形肌。
   2. 用拇指和食指夹住木棒末端，同时用中指和无名指固定肠段（图2F）。操作完成后，LMMP可轻易从肠段上剥离。
10. 除非需要从肌间神经丛中收获肠胶质细胞（EGC），否则丢弃粘附在棉签上的LMMP组织。
11. 使用刀片沿纵轴将肠段完全剖开，从木棒上取下。
12. 将剥离后的肠组织（主要为黏膜层、黏膜下层及环形肌）保存在冰上的DPBS中。重复步骤4.4–4.11，直至所有肠段处理完毕。

5. 上皮黏膜的去除

1. 用精细剪刀将肠道切成约 0.5 cm 的小段。
2. 将组织放入含有 30 mL 冰冷 EDTA/HEPES/DPBS 溶液的无菌 50 mL 圆锥形离心管中。
3. 在 4 °C 下以每分钟约 60 次的频率摇动组织悬液 10 分钟。
4. 用 5 mL 塑料移液管吸取 EDTA/HEPES/DPBS 缓冲液上下吹打一次以预润湿移液管，然后使用该预润湿的移液管对组织和缓冲液悬液进行上下吹打（吹打解离）20 次，以剥离上皮黏膜层。
5. 将 EDTA 孵育后的混合物通过 100 µm 尼龙细胞滤网倾倒，收集组织；弃去浑浊且含黏液的滤过液（图 3）。
6. 用尖头镊子将滤网上截留的组织转移至另一含有 30 mL 冰冷 EDTA/HEPES/DPBS 的新 50 mL 圆锥形离心管中。
7. 再次于 4 °C 下以每分钟约 60 次的频率摇动组织 10 分钟，重复 EDTA/HEPES/DPBS 孵育步骤，以进一步去除上皮黏膜层。
8. 用缓冲液预润湿 5 mL 移液管，然后将组织悬液上下吹打 20 次，以解离黏液细胞。
   注意： 随着更多上皮组织被去除，组织容易粘附在移液管内壁。
9. 第二次孵育后，将混合物通过 100 µm 尼龙细胞滤网倾倒，收集组织并弃去滤过液。第二次滤过液应明显比第一次澄清（图 3）。
10. 重复 10 分钟 EDTA 孵育步骤，直至溶液几乎透明（通常需 3 至 4 次，具体次数取决于组织量及吹打效率）（图 3）。

6. 从固有层和黏膜下层收集肠胶质细胞

1. 将组织从尼龙滤网转移至含有5 mL市售细胞回收溶液的15 mL圆锥形离心管中，在4 °C下轻轻摇动25–30分钟。
2. 轻柔吹打10次，以使肠胶质细胞从固有层中解离。
   1. 通过40 µm滤器过滤，并将滤液收集至干净的50 mL离心管中。
   2. 用1 mL DPBS冲洗尼龙滤膜上的组织。
   3. 弃去组织，将约5–6 mL滤液转移至干净的15 mL圆锥形离心管中。
   4. 在4 °C下，使用水平转子离心机以2,000 x g离心5分钟。
3. 用500 µL移液器枪头轻轻吹打，将含有胶质细胞的沉淀重悬于至少1 mL重悬缓冲液中。避免产生气泡。
   注意：根据孔板数量和板数调整重悬体积。例如，一个6孔板使用1.2 mL，两个6孔板使用2.4 mL，一个12孔板使用2.4 mL。
4. 将200 µL细胞悬液加入每个6孔板的孔中，或100 µL加入PDL-层粘连蛋白包被的12孔板中，孔内需含有胶质细胞生长培养基。
5. 加入细胞后，将培养板放入37 °C培养箱中，期间不要扰动培养皿，以确保尽可能多的细胞贴壁。
   注意：健康的细胞通常在6–8小时内贴壁，但在更换培养基前至少等待24小时，更换时需轻柔吸除培养基及未贴壁的细胞。
6. 细胞接种培养后3–4天可用于实验（图4）。

表1. 胶质细胞重悬培养基的成分。

组分	添加体积	终浓度
DMEM/F12	44.5 mL	_
胎牛血清 (FBS)	5 mL	10%
青霉素-链霉素 (Penicillin-Streptomycin)	500 µL	100 IU/mL 青霉素
链霉素 (Streptomycin)		100 µg/mL 链霉素
庆大霉素 (50 mg/mL 储存液)	20 µL	20 µg/mL

表2. 胶质细胞培养基的成分

组分	添加体积	终浓度
DMEM/F12	44 mL	_
胎牛血清 (FBS)	5 mL	10%
青霉素-链霉素 (100x)	500µL	100 IU/mL (青霉素)
100 µg/mL (链霉素)
庆大霉素 (50 mg/mL 储存液)	20 µL	20 µg/mL
GDNF (10 µg/mL 储存液)	50 µL	10 ng/mL

结果

图 1：小鼠肠道的装置与制备。 （A）在冰上进行肠道分离的装置图，包含已取出的肠道。（B）连接20 G钝头针的5 mL注射器，用于冲洗粪便内容物。（C）经改造的木制棉签末端（约4 cm），浸泡于DPBS缓冲液中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚-D-赖氨酸（1 mg/ml 储存液）	Sigma	A-003-E	按1:10稀释
层粘连蛋白（0.5 mg/ml 储存液）	Sigma	L4544	在冰上稀释至 10 µg/mL
EDTA（0.5 M）	Lonza	51201	在 DPBS 中按1:100稀释
HEPES（1 M）	Corning	36216004	在 DPBS 中按1:100稀释
细胞回收溶液	Corning	354253
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	HyClone	SH30028.02
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	11320033
青霉素-链霉素（100X）	Life Technologies	15140-122
庆大霉素（50 mg/mL 储存液）	Life Technologies	15750060
GDNF（10 µg 储存液）	Sigma	SRP3200
L-谷氨酰胺（200 mM 储存液）	Life Technologies	25030-081
尼龙网细胞筛（100 µm）	Fisher Scientific	22363549
尼龙网细胞筛（40 µm）	Fisher Scientific	22363547
一次性移液管 5 ml	Fisher Scientific	13-678-11D
0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1X）	Life Technologies	25200-056