从猪脑中纯化毛细血管

摘要

来源：Nielsen, S. S. E., 等 改进的建立方法 体外 基于猪脑内皮细胞的血脑屏障模型 J. Vis. Exp. (2017).

本视频展示了从新鲜猪脑中分离毛细血管的过程。该过程包括去除脑膜，从脑组织中分离出灰质，对灰质进行匀浆和过滤以分离毛细血管，最后通过酶消化进一步纯化毛细血管。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

1. 猪脑毛细血管的纯化

1. 采集8-10个5-6月龄家猪的脑组织（例如 从附近屠宰场获取）并将其置于冰上运送到实验室。我们建议在动物死亡后2-3小时内开始以下纯化步骤。
2. 将脑组织置于无菌超净台中，用置于冰上的烧杯中的1 L PBS轻轻冲洗。
3. 一次使用精细镊子小心地去除一个脑组织的脑膜，并将去脑膜的脑组织转移至另一个装有置于冰上的 PBS 的 1 L 烧杯中。操作时间过长会增加去除难度。每个脑组织的处理时间应约为 10–15 分钟。
4. 使用解剖刀一次刮取一个脑组织的灰质，并将分离的组织转移至培养皿（8.8 cm）中²) 中加入20 mL置于冰上的DMEM/F-12培养基。尽可能分离灰质，避免混入白质组织。初始破碎时，将灰质组织通过一支50 mL无针头的注射器推挤。对所有脑组织重复此操作，并将收集的灰质组织合并。操作时间过长会增加组织去除难度。每只脑组织处理时间应控制在10–15分钟。
5. 将分离的灰质材料与DMEM/F-12培养基按1:1比例转移至手持式组织匀浆器的研磨管中。先用松配合的研杵上下研磨8次，随后用紧配合的研杵再上下研磨8次。重复上述操作，直至所有分离的组织材料均被充分匀浆。将匀浆液转移至500 mL的容器中，并用DMEM/F-12培养基稀释至总体积约450 mL。
6. 使用带有滤器支架和140 µm滤网的500 mL蓝盖瓶过滤匀浆液，并通过滤器过滤组织以分离毛细血管。每50 mL匀浆液使用一个滤器，过滤后用DMEM/F-12洗涤每个滤器。
7. 将含有毛细血管的滤膜置于培养皿中，加入含有胰蛋白酶/EDTA（2.5% 胰蛋白酶，0.1 nM EDTA 的 PBS 溶液）、胶原酶 CLS2（2,000 U/mL）和 DNase 1（3,400 U/mL）的 DMEM/F-12 消化液。每培养皿（8.8 cm）使用 1 个²每3个滤网使用20 mL溶液。
8. 将培养皿置于37 °C、180 rpm的摇床上孵育1小时，或每10分钟轻轻搅拌一次。孵育1小时后，用1 mL移液器吸取培养皿中的悬浮液，冲洗滤膜上的毛细血管。
9. 将3个培养皿中的悬浮液分装至2个50 mL离心管中，每管加入10 mL DMEM/F-12以终止消化。
10. 将细胞悬液在 250 x g 4 °C 离心 5 分钟。吸除上清液，将每份沉淀重悬于 10 mL DMEM/F-12 中。向每支试管中再加入 20 mL DMEM/F-12。重复此离心步骤两次。
11. 将离心管置于冰上冷却5分钟，然后将溶液转移至2个新的50 mL离心管中。
12. 将细胞悬液在 250 x 克， 4 °C 下离心5分钟，将每份沉淀重悬于8–10 mL冻存液中（约每使用一个脑组织对应1 mL），冻存液由10% DMSO和FBS组成。
13. 将细胞悬液转移至冻存管中，每管加入1 mL。平均而言，每使用一个脑组织可获得1管细胞，通常可为12–16个培养小室提供内皮细胞。将冻存管置于冷冻盒中，在-80 °C条件下保存至少4小时，可长达过夜。随后，将冻存管转移至液氮罐中长期保存。
    注意： 液氮温度极低，请穿戴适当的防护装备。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F-12	Lonza	BE12-719F
胎牛血清（FBS）	Gibco Invitrogen	10-270-106
胰蛋白酶/EDTA	Gibco Invitrogen	15090-046
DMSO	Sigma-Aldrich	34896
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
DNA酶1	Sigma-Aldrich	D4513
胶原酶CLS2	Sigma-Aldrich	C6885
ddH2O			使用Elga系统制备
15 ml离心管	Cellstar	188271
50 ml离心管	Cellstar	227261
培养皿	Thermo Scientific	150350
冻存管	Thermo Scientific	377224
500 ml瓶	Thermo Scientific	159910/159920
解剖刀	Swann-Morten	REF0211	24型
组织匀浆器	Sigma	D9188
140 μm滤器	MERCK	NY4H04700
细尖弯镊	KLS Martin	12-409-12-07
宽头镊	VWR	82027-390
滤器支架	MERCK Milipore	Swinnex-47
50 ml注射器	Braun	4617509F