一种从大鼠脑组织中分离神经血管单元的方法

摘要

来源：Brzica, H.，等，一种简单且可重复的从新鲜分离的大鼠脑微血管制备膜样本的方法。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了从安乐死大鼠中分离脑微血管的过程。包括脑组织的解剖、组织清洗和机械消化，随后通过反复离心以分离出纯净的微血管组分。

方案

所有涉及样本采集的步骤均按照本机构的IRB指南进行。本方案的操作流程如图1所示。

1. 实验步骤的准备工作

1. 制备脑微血管缓冲液（BMB）。首先称取54.66 g D-甘露醇、1.90 g EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸）和1.46 g 2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇（即Tris）碱，放入一个洁净的烧杯中。加入1.0 L去离子水。使用磁力搅拌器混合BMB缓冲液的各组分。待溶液充分混匀后，用1.0 M HCl将pH值调节至7.4。
2. 在对动物实施麻醉前，预先配制26%葡聚糖溶液（分子量75,000，质量体积比w/v）。请按以下步骤配制葡聚糖溶液。
   注意：必须提前配制该溶液，因为葡聚糖在水性缓冲液中完全溶解通常需要约1.5–2小时。
   1. 将粉末状葡聚糖（每100 mL缓冲液使用26 g）称入一个洁净的烧杯中。
   2. 量取所需体积的BMB缓冲液，并将其加入另一个洁净的烧杯中。
   3. 将BMB缓冲液缓慢倒入盛有葡聚糖粉末的烧杯中。在倾倒过程中，使用玻璃搅拌棒手动搅拌葡聚糖粉末，以促进溶解。
   4. 使用1.0 M HCl在使用前立即调节pH至7.4。
      注意：从12只单独的Sprague-Dawley大鼠（雄性或雌性，3月龄，每只200–250 g）中典型分离脑微血管需要200 mL葡聚糖溶液（即52 g葡聚糖溶于200 mL BMB缓冲液中）。

2. 从 Sprague-Dawley 大鼠中提取脑组织

1. 在完成所需的实验处理后，使用氯胺酮（50 mg/kg；2.5 mL/kg，腹腔注射）和赛拉嗪（10 mg/mL；2.5 mL/kg，i.p.）对Sprague-Dawley大鼠进行麻醉。将氯胺酮和赛拉嗪用0.9%生理盐水稀释至终浓度分别为20 mg/mL和4.0 mg/mL。根据IACUC（机构动物护理与使用委员会）规定，使用锋利的断头器经断头法处死动物。 & 使用委员会）指南。对雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠均采用相同的操作程序。
2. 使用手术剪在大鼠颅骨处做一条横向切口，剥离皮肤。
3. 使用咬骨钳小心移除颅骨骨板并暴露脑组织。
4. 使用刮铲取出脑组织。分离大脑，并将分离的脑组织放入含有5 mL BMB的50 mL锥形管中。使用前立即向每1.0 mL BMB缓冲液中加入1.0 μL蛋白酶抑制剂混合物。

3. 大脑处理

1. 将脑组织从50 mL锥形管转移至洁净的培养皿中。
2. 使用镊子将脑组织在直径为12.5 cm的滤纸上轻轻滚动，以去除 loosely 附着于大脑皮层表面的外层脑膜。轻轻按压脑组织并再次滚动。此步骤中应频繁翻转滤纸。
3. 使用镊子将脉络丛从大脑半球分离。
   注意： 脉络丛呈透明膜状结构，位于脑室表面。
4. 轻轻压平脑组织，并使用镊子去除残留的脑膜和嗅球。
5. 将大脑皮层组织放入预冷的玻璃研钵中。向研钵中加入5.0 mL含有蛋白酶抑制剂混合物的BMB缓冲液。
6. 使用电动匀浆器，在3,700 rpm条件下进行15次上下匀浆。匀浆操作应使用10 mL研钵和研杵组织研磨器完成。每次处理不同样本之间，需用70%乙醇清洗研杵。
   注意： 匀浆过程中的操作速度和力度应保持一致。
7. 将匀浆液倒入已标记的离心管中。

4. 离心步骤

1. 向每个含有脑匀浆的已标记离心管中加入 8.0 mL 的 26% 右旋糖酐溶液。
2. 将离心管倒置两次，然后充分涡旋混匀样品。对每个样品应采用多个角度进行涡旋，以确保脑匀浆溶液与 26% 右旋糖酐溶液充分混合。
3. 在 4 °C 条件下，以 5,000 x g 离心 15 分钟。
   注意： 对于某些分析，比较脑微血管与脑实质是有用的。如果需要评估脑实质中的蛋白表达，可收集此离心步骤的上清液（即脑实质组分），并储存在 -80 °C 以供后续使用。
4. 使用真空抽吸装置和玻璃巴斯德吸管移除上清液。
   注意： 操作时必须小心，避免扰动沉淀。否则，所收集的脑微血管数量将减少，从而显著降低本实验的蛋白得率。
5. 将沉淀重悬于 5.0 mL 含蛋白酶抑制剂混合液的 BMB 缓冲液中（即每 1.0 mL BMB 缓冲液中加入 1.0 μL 蛋白酶抑制剂混合液）。涡旋混匀沉淀，以确保充分混合。
6. 向每个离心管中加入 8.0 mL 的 26% 右旋糖酐溶液，并按照本方案步骤 4.1–4.2 所述进行涡旋。
7. 在 4 °C 条件下，以 5,000 x g 离心 15 分钟。
8. 使用真空瓶和玻璃吸管抽吸上清液，并确保含有脑微血管的沉淀不被破坏。
   注意： 黏附在管壁上的多余物质不含微血管，应小心清除并去除。
9. 重复步骤 4.5 至 4.8 两次。
10. 完成四次右旋糖酐离心步骤后，向每个沉淀中加入 5.0 mL BMB 缓冲液，并涡旋重悬样品。
    注意： 在完成步骤 4.10 后，可收集完整的微血管用于蛋白定位分析。可通过取 50 μL 重悬的微血管沉淀，将其涂布于玻璃显微镜载玻片上实现。随后将微血管在加热块上 95 °C 热固定 10 分钟，再于冰冻乙醇中固定 10 分钟。载玻片可在 4 °C 储存，直至进行成像研究时使用。

结果

图1： 大鼠脑微血管分离及膜样品制备的操作流程与实验方案示意图

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	#P8340	脑微血管缓冲液的组分
D-甘露醇	Sigma-Aldrich	#M4125	脑微血管缓冲液的组分
EGTA	Sigma-Aldrich	#E3889	脑微血管缓冲液的组分
Trizma 碱	Sigma-Aldrich	#T1503	脑微血管缓冲液的组分
葡聚糖（分子量 75,000）	Spectrum Chemical Mftg Corp	#DE125	用于离心步骤中从脑实质分离微血管的葡聚糖
Zetamine	MWI Animal Health	#501072	全身麻醉剂
赛拉嗪	Western Medical Supply	#5530	全身麻醉剂
0.9% 生理盐水溶液	Western Medical Supply	N/A	全身麻醉剂稀释液
滤纸（直径 12.5 cm）	VWR	#28320-100	用于去除脑组织中的软脑膜
离心管	Sarstedt	#60.540.386	用于葡聚糖离心步骤的一次性离心管
Pierce™ 考马斯亮蓝 Plus（Bradford）检测试剂	ThermoFisher Scientific	#23236	用于测定膜制备物中的蛋白质浓度
Wheaton 电动匀浆器	DWK Life Sciences	#903475	样品匀浆所必需
10.0 ml 玻璃研钵和研杵组织研磨器	DWK Life Sciences	#358039	样品匀浆所必需
盐酸	Sigma-Aldrich	#H1758	缓冲液 pH 调节所必需
标准镊子	Fine Science Tools	#91100-12	用于脑组织解剖
Friedman-Pearson 咬骨钳	Fine Science Tools	#16020-14	用于打开颅骨以分离脑组织
50 ml 圆锥形离心管	ThermoFisher Scientific	#352070	用于脑组织分离后的收集
巴斯德玻璃移液管	ThermoFisher Scientific	#13-678-20C	葡聚糖离心后用于吸除细胞碎片
无水乙醇	Sigma-Aldrich	#459836	用于清洁组织研磨器；用蒸馏水稀释至 70%
氯胺酮
冰桶