一种从大鼠脑组织中分离神经血管单元的方法

摘要

来源：Brzica, H.，等，一种简单且可重复的从新鲜分离的大鼠脑微血管制备膜样本的方法。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了从安乐死大鼠中分离脑微血管的过程。包括脑组织的解剖、组织清洗和机械消化，随后通过反复离心以分离出纯净的微血管组分。

方案

所有涉及样本采集的步骤均按照本机构的IRB指南进行。本方案的操作流程如图1所示。

1. 实验步骤的准备工作

1. 制备脑微血管缓冲液（BMB）。首先称取54.66 g D-甘露醇、1.90 g EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸）和1.46 g 2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇（即Tris）碱，放入一个洁净的烧杯中。加入1.0 L去离子水。使用磁力搅拌器混合BMB缓冲液的各组分。待溶液充分混匀后，用1.0 M HCl将pH值调节至7.4。
2. 在对动物实施麻醉前，预先配制26%葡聚糖溶液（分子量75,000，质量体积比w/v）。请按以下步骤配制葡聚糖溶液。
   注意：必须提前配制该溶液，因为葡聚糖在水性缓冲液中完全溶解通常需要约1.5–2小时。
   1. 将粉末状葡聚糖（每100 mL缓冲液使用26 g）称入一个洁净的烧杯中。
   2. 量取所需体积的BMB缓冲液，并将其加入另一个洁净的烧杯中。
   3. 将BMB缓冲液缓慢倒入盛有葡聚糖粉末的烧杯中。在倾倒过程中，使用玻璃搅拌棒手动搅拌葡聚糖粉末，以促进溶解。
   4. 使用1.0 M HCl在使用前立即调节pH至7.4。
      注意：从12只单独的S....

结果

图1： 大鼠脑微血管分离及膜样品制备的操作流程与实验方案示意图

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	#P8340	脑微血管缓冲液的组分
D-甘露醇	Sigma-Aldrich	#M4125	脑微血管缓冲液的组分
EGTA	Sigma-Aldrich	#E3889	脑微血管缓冲液的组分
Trizma 碱	Sigma-Aldrich	#T1503	脑微血管缓冲液的组分
葡聚糖（分子量 75,000）	Spectrum Chemical Mftg Corp	#DE125	用于离心步骤中从脑实质分离微血管的葡聚糖
Zetamine	MWI Animal Health	#501072	全身麻醉剂
赛拉嗪	Western Medical Supply	#5530	全身麻醉剂
0.9% 生理盐水溶液	Western Medical Supply	N/A	全身麻醉剂稀释液
滤纸（直径 12.5 cm）	VWR	#28320-100	用于去除脑组织中的软脑膜
离心管	Sarstedt	#60.540.386	用于葡聚糖离心步骤的一次性离心管
Pierce™ 考马斯亮蓝 Plus（Bradford）检测试剂	ThermoFisher Scientific	#23236	用于测定膜制备物中的蛋白质浓度
Wheaton 电动匀浆器	DWK Life Sciences	#903475	样品匀浆所必需
10.0 ml 玻璃研钵和研杵组织研磨器	DWK Life Sciences	#358039	样品匀浆所必需
盐酸	Sigma-Aldrich	#H1758	缓冲液 pH 调节所必需
标准镊子	Fine Science Tools	#91100-12	用于脑组织解剖
Friedman-Pearson 咬骨钳	Fine Science Tools	#16020-14	用于打开颅骨以分离脑组织
50 ml 圆锥形离心管	ThermoFisher Scientific	#352070	用于脑组织分离后的收集
巴斯德玻璃移液管	ThermoFisher Scientific	#13-678-20C	葡聚糖离心后用于吸除细胞碎片
无水乙醇	Sigma-Aldrich	#459836	用于清洁组织研磨器；用蒸馏水稀释至 70%
氯胺酮
冰桶