由人类神经干细胞生成皮层锥体神经元

摘要

来源：Gouder, L.，等。基于人诱导性多能干细胞的锥体神经元树突棘三维定量分析。J. Vis. Exp. （2015）

本视频介绍了一种制备包被多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的玻璃盖玻片的方法，以增强神经干细胞的黏附和生长。该技术包括依次进行的孵育和洗涤步骤，有助于形成支持性基质，促进神经元细胞的生长与分化，模拟神经元中天然存在的结构。

方案

1. 神经元培养
   注意： 成纤维细胞重编程为多能干细胞、向背侧端脑谱系的定向分化、晚期皮质前体细胞（LCP）的分离、扩增及建系方法详见于Boissart 等. 根据Boissart的方法，也对LCP样细胞进行了神经元分化。 等 稍作修改。已有其他方法用于将成纤维细胞直接重编程为诱导性多能干细胞，随后将其分化为神经元。本方案被保留，因其可选择性地生成锥体样谷氨酸能神经元。
   1. 用多聚鸟氨酸（以 DPBS（Dulbecco 磷酸盐缓冲液）稀释至 1/6，储存浓度为 0.01%）处理 6 孔培养板中的玻璃盖玻片，过夜孵育，随后用 DPBS 洗涤三次。然后在生物安全柜中加入层粘连蛋白（储存浓度为 1 mg/ml，用 DPBS 稀释 500 倍），孵育至少 10 小时。
   2. 以低密度接种并运送NSC（50,000个细胞/cm²）²在6孔培养板中加入含玻璃盖玻片的3 ml培养基进行培养，培养基成分为DMEM（Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium）/F12（500 ml）、N2添加剂2瓶（每瓶5 ml）、B27添加剂2瓶（每瓶10 ml）、青霉素-链霉素溶液10 ml（青霉素 = 10,000 units/ml，链霉素 = 10,000 units/ml）、2-巯基乙醇1 ml（储存液：50 mM）以及层粘连蛋白（1/500），不添加生长因子。 关键步骤： 此步骤需小心操作，通过缓慢旋转的方式加入细胞，以减少细胞聚集。
   3. 吸除培养基。加入含有2 µg/ml新鲜层粘连蛋白溶液的新鲜N2B27培养基，以保持神经元附着在玻璃盖玻片上并防止成团。每3天更换一次培养基。在添加新鲜培养基前，保留部分原有培养基（200 µl），以防止细胞干燥。或者，也可快速操作并更换全部体积（3 ml）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PD-PBS (1X)，不含钙、镁和酚红	Gibco/ Life Technologies	14190169
多聚-L-鸟氨酸溶液 生物试剂	Sigma Aldrich	P4957
小鼠层粘连蛋白	Dutscher Dominique	354232
N2 添加剂	Gibco/ Life Technologies	17502048
B-27 添加剂（不含维生素A，50X）	Gibco/ Life Technologies	12587010
DMEM/营养混合物 F-12 含 GLUT-I	Gibco/ Life Technologies	31331028
Neurobasal 培养基 无血清培养基	Gibco/ Life Technologies	21103049
2-巯基乙醇	Gibco/ Life Technologies	31350-010
青霉素-链霉素	Gibco/ Life Technologies	15140-122
13 mm 盖玻片	VWR	631-0150
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭试剂	Gibco/ Life Technologies	P36931
Tween(R) 20 Bioextra，粘稠液体	Sigma Aldrich Chimie	P7949
人成纤维细胞	Coriell 细胞库	GM 4603 和 GM 1869	美国新泽西州卡姆登 Coriell 医学研究所
CO2 培养箱
6 孔培养板
移液器