制备幼鼠脑的上丘-丘脑皮层切片

摘要

来源：Slater, B. J., 等，小鼠丘脑皮层脑片的改良，结合3D打印培养室组件与多尺度光学成像。J. Vis. Exp. (2015)

该视频展示了从小鼠幼崽脑组织制备上丘-丘脑-大脑皮层脑片的过程。将分离的脑组织置于带有标记的载片上并以特定角度切割，使听觉中脑与前脑处于同一平面。随后使用振动切片机对脑组织进行切片，并将包含主要听觉中脑和前脑结构的脑片转移至孵育室中保存。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 小鼠脑组织切片前的准备及脑组织取出

1. 准备灌注和脑片孵育。
   1. 在切片前约30分钟，配制高蔗糖切割液以及用于记录或成像前孵育脑片的低钙人工脑脊液（aCSF）。
   2. 准备好灌注和切片所需的所有工具（大号钝头剪刀、小弹簧剪刀、解剖镊、大剪刀或断头台、虹膜剪、珠宝商镊子、带27G × 1/2英寸针头的10 ml注射器、一小块1 cm × 2 cm的滤纸，以及尖端折断的巴斯德移液管用于转移脑片），并准备好灌注托盘。
   3. 将孵育 chamber 置于含氧aCSF中，并放入32 ^oC水浴中，同时准备一个装有切割液的培养皿。
2. 准备切片用的切片台。
   1. 切取一小块约1 cm³的3%琼脂作为脑组织的挡板，并切取一块1.5 cm × 1.5 mm × 3 mm的琼脂作为隆起物，用于支撑下丘（IC）。
   2. 使用氰基丙烯酸盐胶水将挡板固定在切片台上，并将隆起物粘在挡板右侧，使其与挡板形成80^o夹角。
3. 取出脑组织。
   1. 使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（3 mg/kg）（或经伦理委员会批准的类似方案）对出生后第12至20天（p12–p20，理想为p14–18）的小鼠进行深度麻醉。
      注意：通过脚趾夹捏无反应确认麻醉充分。由于动物处于短暂麻醉状态，无需使用眼用软膏。
   2. 使用钝头剪刀从剑突至颈部暴露胸腔。
      1. 找到剑突，做一条约1.5 cm长的横向切口。
      2. 从上述横向切口两端各向上做一条长约1.5 cm的纵向切口，直至肩部。
   3. 剪开膈肌和肋软骨连接处，暴露心脏。
   4. 使用小弹簧剪刀在右心房处做一个2–5 mm的小切口，从心脏腹侧剪至背侧。
   5. 使用带27G × 1/2英寸针头的10 ml注射器穿刺左心室，并迅速灌注高蔗糖切割液。
   6. 当血液变清亮后，使用大剪刀剪下头部。
      注意：我们尚未系统评估灌注的必要性。然而根据经验，对如此年幼的小鼠进行经心灌注几乎可达到近100%的成功率，且其优势在于可清除红细胞，避免红细胞自发荧光对成像造成干扰。
   7. 沿中线剪开皮肤以暴露颅骨。
   8. 使用弯头虹膜剪在双眼之间剪开颅骨，然后从该切口开始，沿颅骨中线缝合线小心地从前向后剪开，注意不要损伤下方脑组织。
      注意：硬脑膜通常会随颅骨一起被移除。如有必要，在小心取出脑组织前先去除硬脑膜。
   9. 使用珠宝商镊子轻轻撬开颅骨，小心取出脑组织，并立即放入切割液中。注意避免损伤大脑皮层。

2. 准备脑组织用于切片

1. 准备将脑组织安装到振动切片机载物台上。
   1. 使用一张标有两条相互垂直的直线（90^o）以及一条从左上至右下、与水平线成17^o夹角的斜线的载玻片，在两条线交点处将脑组织背侧朝上放置；用剃刀刀片切除前端2–4 mm的脑组织，形成一个平坦的切面。
   2. 将脑组织尾侧朝上放置在新形成的平坦切面上，使脑的背侧表面与水平线对齐，脑中线与垂直线对齐。
   3. 将剃刀刀片与17^o线对齐，将刀片倾斜至30^o角，进行双重斜切，切除右侧皮层约3 mm的组织（即与水平面成17^o，与冠状面成60^o）。
2. 将脑组织安装至振动切片机载物台上。
   1. 在脑组织腹侧放置一小块尺寸为1 cm × 2 cm的滤纸，使其长边方向与脑中线垂直。
   2. 小心地在挡块前方区域（以及凸起左侧）涂抹少量氰基丙烯酸酯胶水。
   3. 将经过双重斜切的脑组织切面朝下贴合于胶水上，使脑的尾部和后脑部分支撑在凸起上，脑的右侧紧贴挡块。
   4. 轻柔地向下按压脑组织，确保整个底面与切片腔充分接触。

3. 获取上丘-丘脑-皮层切片

1. 迅速取下切片台并放入振动切片机中，向切片台内加入切片液。
2. 将刀片与脑组织顶部（腹侧）对齐。
3. 从脑组织顶部切除 1–1.5 mm，随后切下 300–500 µm 的脑片，并在切除后评估切片深度。
   注意：当丘脑中央核（IC）、内侧膝状体（MGB）和外侧膝状核（LGN）均可见，且齿状回呈“C”形时，切取 1 至 2 片 600 µm 厚的脑片。参见 图 1A。
4. 将脑片放入预热至 32 ^oC 的孵育 chamber 中。

结果

图1. 丘脑-丘脑皮层脑切片的黄素蛋白自体荧光成像。 (A) 通过黄素蛋白自体荧光确认的连接完整的上丘-丘脑-皮层脑切片。以0.05 Hz对下丘（IC）进行电刺激，以4 Hz成像并经傅里叶处理以显示刺激频率处的信号强度。注意内侧膝状体（MGB）、丘脑网状核（TRN）、听觉皮层（AC）以及纹状体（CS）均被激活。(B) 无连接的切片。对IC进行电刺激，仅观察到MGB被激活。整个通路可能未被完整保留，原因可能是17^o的角度略陡。(C) AC的非典型激活。对IC进行电刺激后，AC被激活，但在MGB或TRN中未见明显...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高蔗糖切割液			以 mM 计：206 蔗糖，10.0 MgCl2，11.0 葡萄糖，1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO₃3, 0.5 CaCl2，2.5 KCl，pH 7.4
低钙人工脑脊液			以 mM 计：126 NaCl，3.0 MgCl2，10.0 葡萄糖，1.25 NaH2PO4，26 NaHCO₃3，1.0 CaCl2，2.5 KCl，pH 7.4
aCSF			以 mM 计：126 NaCl，2.0 MgCl2，10.0 葡萄糖，1.25 NaH2PO4，26 NaHCO₃3，2.0 CaCl2，2.5 KCl，pH 7.4
DMSO	Life Technologies	D12345	批号：1572C502
大培养皿	Fisherbrand	08-757-13	100x15毫米培养皿
小型培养皿	Falcon	353001	35x10毫米培养皿
抬升式培养膜	Millicell	PICMORG50	用于维持切片两侧的含氧液体灌注。
用于脑组织封闭的琼脂糖			水中重量百分比为3%