利用基因编辑的人诱导多能干细胞体外诱导神经肌肉接头

摘要

来源：Lin, C. 等，利用人诱导性多能干细胞体外构建神经肌肉接头。J. Vis. Exp.(2020)。

本实验详细介绍了一种利用人诱导性多能干细胞生成神经肌肉接头的方法。该方法通过分阶段的分化过程，促进肌管和运动神经元的发育以及突触的形成，从而获得具有功能的神经肌肉接头。

方案

1. 细胞外基质（ECM）包被板的制备

1. 用预冷的1×PBS将ECM（参见材料表）稀释至终浓度为2%
2. 在50 mL塑料离心管中，将1 mL ECM加入49 mL的1×PBS中，通过反复吹打混匀数次。
3. 在6孔板的每个孔中放入1个盖玻片，每孔加入1.5 mL的2% ECM。
4. 将6孔板置于37 °C孵育2 h。
5. 吸除孔板中的ECM，将板置于4 °C保存备用。

2. 诱导多能干细胞向神经肌肉接头的分化

1. 在第1节中准备的6孔板中，每孔接种4 × 10⁵个iPSCs。确保将细胞接种在预先置于孔中的盖玻片上。
   注意：本研究中使用了201B7^MYOD iPS细胞系。
   1. 从6 cm培养皿中的iPSCs中移除培养基，并用1× PBS洗涤iPSCs一次。
   2. 向培养皿中加入1 mL细胞解离溶液，在37 °C下孵育10分钟。
   3. 向培养皿中加入3 mL灵长类胚胎干细胞（ES）培养基，轻轻吹打3次。
   4. 收集含有解离iPSCs的上清液至50 mL塑料管中，在4 °C下以160 × g离心5分钟。
   5. 小心吸除上清液，将iPSCs重悬于3 mL含10 µM Y27632的灵长类ES细胞培养基中，并使用血细胞计数板计数细胞数量。
   6. 用含10 µM Y27632的灵长类ES细胞培养基将iPSCs稀释至浓度为2 × 10⁵个细胞/mL，并向第1节所述的预先置于孔中的盖玻片上加入2 mL细胞悬液。

3. 诱导iPSCs形成NMJ

1. 第1天，在将iPSC接种至6孔板24小时后，吸去培养基，每孔加入2 mL含有1 µg/mL多西环素的新鲜灵长类ES细胞培养基。
2. 从第2天到第10天，每天更换培养基，每孔加入2 mL含有1 µg/mL多西环素（终浓度）的成肌分化培养基（MDM）（表1）。
3. 从第11天开始，每孔更换为2 mL神经肌肉接头培养基（NMJ培养基）（表1），此后每3‒4天换液一次，直至第30天。
4. 在第30天使用倒置相差显微镜观察已分化的神经肌肉接头。所得神经肌肉接头可用于后续分析。

结果

表1：培养基配方。

成肌分化培养基 (MDM)	MEM-alpha	500mL
	100mM 2-ME	1117μL
	多西环素	1μg/mL
	KSR	56mL (终浓度至 10%)
	青霉素/链霉素	2.5mL

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养基、生长因子与试剂
2-巯基乙醇	Nacalai tesque	21418-42
B27, Gibco	Gibco	12587-001
BDNF	R & D Systems	248-BD
细胞解离液，Accumax	STEMCELL Technologies	#07921
临界点干燥仪	Hitachi	ES-2030
多西环素	Takara	631311
ECM, Matrigel（生长因子减量）	Corning	356230
GDNF	R & D Systems	212-GD
凝胶化，IP凝胶	Geno Staff	PG20-1
离子溅射仪	JEOL	JEC3000FC
iPSC培养基，mTeSR	STEMCELL Technologies	85850
KnockOut SR（KSR）	Gibco	10828-028
活细胞显微镜	Nikon		Eclipse Ti显微镜
MEM-α	Gibco	12571-071
N2, Gibco	Gibco	17502-048
Neurobasal培养基	Gibco	21103-049
NT3	R & D Systems	267-N3
灵长类ES细胞培养基	ReproCell	RCHEMD001
SEM	Hitachi	S-4700
TEM	Hitachi	H7650
Y27632	Wako Chemicals GmbH	253-00513