来自工程化人诱导多能干细胞的神经肌肉接头的体外诱导

摘要

来源:Lin， C. et al.， 人诱导多能干细胞诱导的体外神经肌肉接头。J. Vis. Exp.（2020 年）。

该实验详细介绍了一种从人类诱导的多能干细胞产生神经肌肉接头的方法。它使用分阶段的分化过程来促进肌管和运动神经元的发育和突触的形成，从而产生功能性神经肌肉接头。

方案

1. 细胞外基质 （ECM） 包被板的制备

1. 用冰冷的 1x PBS 稀释 ECM（参见材料表）至终浓度为 2%
2. 在 50 mL 塑料管中将 1 mL ECM 添加到 49 mL 1x PBS 中。通过上下吹打数次充分混合。
3. 将 1 个盖玻片放入 6 孔板的每个孔中。向每个孔中加入 1.5 mL 的 2% ECM。
4. 将孔板与 2% ECM 在 37 °C 下孵育 2 小时。
5. 从孔板中吸出 ECM 并在使用前将板储存在 4 °C。

2. iPSC 向 NMJ 的分化

1. 在第 1 部分制备的 6 孔板上每孔接种 4 x 10⁵ 个 iPSC。确保将细胞接种在预先存放在孔中的盖玻片上。
   注意:在本研究中，使用了 201B7^MYOD iPS 细胞系。
   1. 从 6 cm 培养皿上的 iPSC 中取出培养基，并用 1x PBS 洗涤 iPSC 一次。
   2. 向培养皿中加入 1 mL 细胞分离溶液，并在 37 °C 下孵育 10 分钟。
   3. 向培养皿中加入 3 mL 灵长类动物胚胎干细胞 （ES） 细胞培养基，轻轻移液 3 次。
   4. 将含有分离的 iPSC 的上清液收集到 50 mL 塑料管中，并在 4 °C 下以 160 x g 离心 5 分钟。
   5. 小心吸出上清液，将 iPSC 重悬于含有 10 μM Y27632 的 3 mL 灵长类动物 ES 细胞培养基中，并使用血细胞计数器计数细胞数。
   6. 用灵长类动物 ES 细胞培养基和 10 μM Y27632 将 iPSC 稀释至 2 x 10⁵ 个细胞/mL 的浓度。在预先存放在第 1 节中描述的孔中的盖玻片上添加 2 mL 的 iPSC。

3. 将 iPSC 诱导到 NMJ

1. 第 1 天，将 iPSC 接种到 6 孔板后 24 小时，去除培养基并用 2 mL 新鲜的灵长类动物 ES 细胞培养基替换，每个孔中含有 1 μg/mL 多西环素。
2. 将含有 1 μg/mL 多西环素（终浓度）的 2 mL 产肌分化培养基 （MDM）（表 1）更换到每个孔中。从第 2 天到第 10 天每天刷新培养基。
3. 从第 11 天开始，将培养基切换到每个孔中 2 mL 的 NMJ 培养基（表 1）。此后每 3-4 天刷新一次培养基，直到第 30 天。
4. 在第 30 天通过相位倒置显微镜观察分化的 NMJ。NMJ 可用于以下分析。

结果

表 1:介质公式。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 肌源性分化培养基 （MDM） MEM-α 500 毫升 100 毫米 2-ME 1117 微升 多西环素 1 微克/毫升 KSR 56 mL（最终为 10%） 笔/链球菌 2.5 毫升 总

材料