一种用于神经元培养的背根神经节收获与解离技术

摘要

来源：de Luca, A. C. 等, 背根神经节神经元与分化后的脂肪源性干细胞：一种 体外 研究周围神经再生的共培养模型 视频实验杂志 (2015).

本视频展示了一种从背根神经节（DRG）中分离神经元的方法。从大鼠脊柱分离背根神经节（DRG），经酶处理后，通过机械解离获得单细胞悬液。利用密度梯度离心法将神经元与胶质细胞分离，并在生长培养基中进行培养。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 实验设置

1. 开始组织和细胞收获前，检查所有工具是否无菌。必要时，对一把锋利的手术剪、一把超细镊子和一把细标准镊子进行高压灭菌。此外，根据需要，在接种细胞前使用紫外灭菌、乙醇处理或蒸汽灭菌对每种基质进行灭菌。
2. 神经元收获与解离所需培养基和储备液的配制
   1. 通过向 Ham's F12 培养基中添加 1% 青霉素-链霉素（PS）和 1% N2 补充剂，配制 Bottenstein 和 Sato 的（BS）培养基。若使用 24 孔板，则按每孔 500 µl 计算所需终体积。
   2. 在 Ham's F12 培养基中配制浓度为 1.25% wt/v 的 IV 型胶原酶储备液。过滤除菌后，分装为 200 µl 每份，于 -20 °C 保存。
   3. 在 Ham's F12 培养基中配制浓度为 2.5% wt/v 的牛胰蛋白酶储备液，过滤除菌后分装为 200 µl 每份，于 -20 °C 保存。
   4. 在含 1 mg/ml 无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）的 F12 培养基滤液中配制浓度为 5 µg/mL 的神经生长因子（NGF）储备液，分装为 200 µl 每份，于 -20 °C 保存。NGF 重悬后不得再次过滤。
3. 若未进行表面....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 µm 细胞滤筛	BD Biosciences	352360	可使用 70 μm 滤筛（货号 352350）作为替代
15 mL 塑料管	Sarstedt	62.554.002
50 mL 塑料管	Sarstedt	62.547.004
75 cm2 培养瓶	Corning	BC301
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A9205
IV 型胶原酶	Worthington Biochemical	LS004188	注：该胶原酶仅用于解离背根神经节（DRG）组织块
胎牛血清（FBS）	Biosera	FB-1001
玻璃移液管	Fisher Scientific	FB50253	尖锐物品，需按规定妥善处理
Ham's F12 培养基	Sigma	N6658	除非特别说明，使用前需在 37 °C 水浴中预热
Hank's 平衡盐溶液（HBSS）	Sigma	H9394	除非特别说明，使用前需在 37 °C 水浴中预热
N-2 补充剂（100 倍）	Invitrogen	17502
小鼠颌下腺神经生长因子 2.5S 蛋白（NGF）	Millipore	NC011
青霉素-链霉素溶液（PS）	Sigma	P0781
培养皿	Corning	430165
胰蛋白酶（2x 牛胰）	Worthington Biochemical	LS003703	用于背根神经节（DRG）的解离