一种用于神经元培养的背根神经节收获与解离技术

摘要

来源：de Luca, A. C. 等, 背根神经节神经元与分化后的脂肪源性干细胞：一种 体外 研究周围神经再生的共培养模型 视频实验杂志 (2015).

本视频展示了一种从背根神经节（DRG）中分离神经元的方法。从大鼠脊柱分离背根神经节（DRG），经酶处理后，通过机械解离获得单细胞悬液。利用密度梯度离心法将神经元与胶质细胞分离，并在生长培养基中进行培养。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 实验设置

1. 开始组织和细胞收获前，检查所有工具是否无菌。必要时，对一把锋利的手术剪、一把超细镊子和一把细标准镊子进行高压灭菌。此外，根据需要，在接种细胞前使用紫外灭菌、乙醇处理或蒸汽灭菌对每种基质进行灭菌。
2. 神经元收获与解离所需培养基和储备液的配制
   1. 通过向 Ham's F12 培养基中添加 1% 青霉素-链霉素（PS）和 1% N2 补充剂，配制 Bottenstein 和 Sato 的（BS）培养基。若使用 24 孔板，则按每孔 500 µl 计算所需终体积。
   2. 在 Ham's F12 培养基中配制浓度为 1.25% wt/v 的 IV 型胶原酶储备液。过滤除菌后，分装为 200 µl 每份，于 -20 °C 保存。
   3. 在 Ham's F12 培养基中配制浓度为 2.5% wt/v 的牛胰蛋白酶储备液，过滤除菌后分装为 200 µl 每份，于 -20 °C 保存。
   4. 在含 1 mg/ml 无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）的 F12 培养基滤液中配制浓度为 5 µg/mL 的神经生长因子（NGF）储备液，分装为 200 µl 每份，于 -20 °C 保存。NGF 重悬后不得再次过滤。
3. 若未进行表面修饰，则根据需要使用聚-D-赖氨酸（0.1 mg/ml，室温 [RT] 孵育 15 分钟）和/或层粘连蛋白（2–10 µg/cm²，37 °C 孵育 2 小时）对盖玻片/培养板进行包被，以支持神经元贴附和神经突起生长。
4. 使用前始终将培养基在 37 °C 水浴中预热。

2. 背根神经节（DRG）神经元的收获与解离

1. 通过颈椎脱位和断头处死大鼠，剃除大鼠体毛并掀开皮肤以暴露脊柱。使用锋利的剪刀小心切除脊柱，注意保护其中的深部器官和血管。将脊柱置于培养皿中，转移至II级生物安全柜内，并去除所有背部组织。
2. 沿纵轴方向用无菌且锋利的手术剪将脊柱切成两半，以暴露脊髓组织。此时，建议在肋骨下方水平将脊柱进一步分为两个较小的节段，以便于后续背根神经节（DRG）神经元的分离操作。使用精细镊子轻轻去除所有脊髓组织，注意避免牵拉或移除DRG的神经根。这样可使DRG及其神经根仍保留在椎管内并暴露出来。观察可见从椎管直接伸出的白色丝状结构即为DRG。
3. 使用极细镊子从椎管中完整取出整个DRG神经根（不仅限于DRG本体），深入椎管内部操作时注意不要损伤神经节的神经根。将分离出的DRG转移至一个小型培养皿（60 mm²）中，内含3–4 ml添加了1%青霉素-链霉素（PS）的Ham's F12培养基。若使用不同动物，应分别使用独立的培养皿。
4. 在解剖显微镜下，使用无菌镊子和手术刀清除围绕神经节的多余神经根组织，以减少胶质细胞污染。随后将DRG转移至另一个小型培养皿（35 mm²）中，内含1.8 ml新鲜F12培养基。
5. 加入200 µl浓度为1.25% wt/v的IV型胶原酶储备液（终浓度为0.125%），将DRG置于37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。使用玻璃移液管小心吸除培养基，注意避免吸走或损伤DRG。加入含0.125% wt/v IV型胶原酶的新鲜F12培养基，按前述条件再次孵育1小时。
6. 吸除培养基后，用F12培养基轻柔清洗DRG一次。然后加入1.8 ml F12培养基和200 µl胰蛋白酶（终浓度为0.25% wt/v），于37 °C、5% CO₂条件下孵育30分钟。
7. 去除胰蛋白酶溶液，加入1 ml含500 µl胎牛血清（FBS）的F12培养基以终止酶反应。吸除上清液，并用F12培养基轻柔清洗DRG三次，以彻底去除血清残留。
8. 加入2 ml新鲜F12培养基，使用玻璃移液管小心将DRG连同培养基转移至15 ml离心管中。通过反复吹打（约8–10次）进行机械性解离，使用玻璃移液管（也可用塑料枪头替代）轻柔分散DRG神经元。
9. 静置离心管使细胞沉淀沉降至管底，收集上清液至新管中。向原管中加入2 ml新鲜F12培养基，重复使用玻璃移液管进行机械解离。重复此步骤直至悬液均匀（约3–4次），并将所有解离后的DRG细胞收集至同一新管中。该方法可降低机械解离带来的细胞应激，提高神经元存活率。
10. 使用100 µm细胞滤网将所得的匀浆悬液过滤至新的15 ml离心管中，以去除未完全解离的组织块及其他碎片。此步骤中，可先将细胞悬液过滤至50 ml离心管，再用玻璃移液管转移至较小离心管中。将悬液在110 g条件下离心5分钟。
11. 通过将500 µl 30% BSA溶液与500 µl F12培养基混合，配制15% BSA溶液。沿15 ml离心管内壁缓慢滴加该溶液，形成渐变的蛋白梯度层。操作时建议将离心管倾斜约45°角，并以管壁上的刻度标记为参考，缓慢释放BSA溶液以形成清晰的“轨迹”。
12. 从步骤2.10中吸除上清液，保留管底约500 µl液体，将细胞沉淀重悬于该剩余液体中。沿步骤2.11中预先形成的蛋白梯度层缓慢加入细胞悬液（以管壁刻度为参考），随后在500 g条件下离心5分钟。
13. 吸除上清液，将沉淀重悬于1 ml改良BS培养基中。
    注意：DRG神经元的重悬体积可根据所需最终细胞浓度及待接种样本数量进行调整。一只动物所提供的细胞足以完成24孔板实验。
14. 将接种后的样本置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育2小时，以促进细胞贴壁，随后加入含50 ng/ml神经生长因子（NGF）的新鲜BS培养基。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 µm 细胞滤筛	BD Biosciences	352360	可使用 70 μm 滤筛（货号 352350）作为替代
15 mL 塑料管	Sarstedt	62.554.002
50 mL 塑料管	Sarstedt	62.547.004
75 cm2 培养瓶	Corning	BC301
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A9205
IV 型胶原酶	Worthington Biochemical	LS004188	注：该胶原酶仅用于解离背根神经节（DRG）组织块
胎牛血清（FBS）	Biosera	FB-1001
玻璃移液管	Fisher Scientific	FB50253	尖锐物品，需按规定妥善处理
Ham's F12 培养基	Sigma	N6658	除非特别说明，使用前需在 37 °C 水浴中预热
Hank's 平衡盐溶液（HBSS）	Sigma	H9394	除非特别说明，使用前需在 37 °C 水浴中预热
N-2 补充剂（100 倍）	Invitrogen	17502
小鼠颌下腺神经生长因子 2.5S 蛋白（NGF）	Millipore	NC011
青霉素-链霉素溶液（PS）	Sigma	P0781
培养皿	Corning	430165
胰蛋白酶（2x 牛胰）	Worthington Biochemical	LS003703	用于背根神经节（DRG）的解离