形态学分析 果蝇 利用遗传镶嵌体研究幼虫外周感觉神经元的树突和轴突

摘要

Drosophila 幼虫外周神经系统中的树突分支感觉神经元是研究神经元分化普遍机制及神经元类型特异性机制的有用模型。本文提供了一种实用指南，用于构建和分析树突分支感觉神经元的遗传嵌合体。

摘要

神经系统发育需要精确指定神经元的位置和身份，随后进行准确的神经元类别特异性树突发育和轴突连接。近年来，果蝇幼虫外周神经系统中的树突状分支（DA）感觉神经元已成为研究树突发育和轴突投射机制的重要模型。 果蝇 幼虫外周神经系统（PNS）已成为研究神经元分化普遍机制及类别特异性机制的有力遗传模型。 DA神经元主要分为四类（I-IV）。¹根据树突分支复杂性递增的顺序命名，其分化过程的遗传调控具有类别特异性的差异^2-10. 多巴胺能（DA）感觉系统是研究控制树突形态分子机制的实用模型^11-13 因为：1）可以利用果蝇中强大的遗传学工具，2）多巴胺能神经元的树突分支仅在光学透明的幼虫表皮下方以二维方式延展，便于高分辨率成像观察 体内3）不同类别神经元树突形态的多样性有助于进行比较分析，以发现调控简单型与高度分支型树突结构形成的关键因素；4）不同多巴胺能神经元具有典型且可辨识的树突分支形态，有利于开展形态计量学的统计分析。

多巴胺能神经元的活动可调节幼虫运动中枢模式发生器的输出^14-16。不同类型的多巴胺能神经元具有不同的感觉模态，其激活可引发不同的行为反应^14,16-20。此外，不同类型神经元的轴突在黑腹果蝇（Drosophila）幼虫腹神经索（VNC）中枢神经系统中的投射具有典型的模式²¹。这些轴突投射以拓扑方式表征了多巴胺能神经元的感觉模态及其树突区域在体壁上的位置^7,22,23。因此，研究多巴胺能神经元轴突投射可用于阐明拓扑映射机制^7,22,23，以及调控幼虫运动的简单神经环路的连接方式^14-17。

本文提供了一种实用指南，用于通过MARCM（利用可抑制细胞标记物的嵌合体分析）²⁴和Flp-out^22,26,27技术（如图1所示）标记多巴胺能神经元，从而生成并分析遗传嵌合体^1,10,25。

方案

1. 试剂的准备

1. 制备无 Ca⁺⁺ 的 HL3.1 生理盐水²⁸。
   1. 单位为 mM：70 NaCl、5 KCl、20 MgCl₂、10 NaHCO₃、5 HEPES、115 蔗糖和 5 海藻糖；pH 值调至 7.2。过滤除菌后于 4°C 保存。
      注意：无 Ca⁺⁺ 溶液可防止解剖过程中肌肉收缩。
2. 制备多聚-L-赖氨酸（PLL）包被的盖玻片。
   1. 将 100 mg PLL 溶解于 4.2 ml 水中，分装为每管 300 μl 至离心管中，于 -20°C 冻存。
   2. 在包被盖玻片前，先取出一管解冻，用 ddH₂O 定容至 10 ml，再加入 20 μl Kodak Photo-Flo；最终 PLL 浓度为 0.7 mg/ml。
   3. 将盖玻片浸入 PLL 溶液中 30 分钟，取出后干燥，再用清水快速漂洗并再次干燥。重复此步骤两次。处理后的盖玻片可保存约一个月。

2. 遗传杂交

1. 生成MARCM克隆。以下是一个使用泛DA驱动子的例子^11,27：
   FRT2A x hsFLP; Gal4^109(2)80, UAS-mCD8::GFP; tub-Gal80 FRT2A/SM5-TM6B
2. 生成Flp-out克隆。以下是一个使用IV类特异性驱动子的例子⁸：
   ppk-Gal4 x yw, hsFLP;UAS-FRT-CD2,y⁺-stop-FRT-mCD8::GFP

3. 胚胎的收集

1. 保持 果蝇 在25°C下将果蝇转移至收集瓶中，并在苹果汁琼脂平板上收集胚胎²⁹ 用一层薄薄的酵母糊涂抹均匀^30,31.

4. 胚胎的热激处理

1. 将一个空培养皿与已放置胚胎的苹果汁琼脂培养皿相对放置，用Parafilm密封两个培养皿的周围（图2）。
2. 热激过程中，将培养皿浸入水浴，并用金属重物压住使其保持在水下。
3. 对于MARCM胚胎
   1. 收集胚胎2小时，随后在直径10 cm的培养皿中于25°C条件下继续孵育2小时，培养皿周围需放置湿润的吸水纸。
      注意：调整热激程序会改变克隆产生的频率。
   2. 若希望获得较少数量的克隆，以实现单个孤立神经元为目标，将培养皿在38°C水浴中热激1小时。
   3. 若希望获得较多数量的克隆，先在38°C水浴中热激45分钟，室温恢复30分钟，再进行额外30分钟的热激。
4. 收集Flp-out胚胎24小时，并在38°C条件下热激1小时。

5. 克隆筛选

1. 热激后，取下防水装置的盖子，将苹果汁琼脂平板放入直径10 cm的培养皿中，并用湿润的纸巾包围。在25°C下培养胚胎及后续幼虫，直至进入游走型3^rd龄幼虫阶段。
   注意：培养条件，尤其是营养状况，已被证明会影响DA树突分支形态^32,33。确保幼虫在整个发育过程中始终可接触到酵母糊；根据需要进行观察并及时补充酵母糊。
2. 从本实验方案的此步骤开始，使用昆虫镊子轻柔地操作幼虫。
3. 用自来水短暂而轻柔地冲洗幼虫，然后将其转移至琼脂平板上。
   注意：此步骤可减少幼虫体表食物或污物引起的背景自发荧光。
4. 在高倍荧光解剖显微镜下观察幼虫，筛选出体壁中具有GFP阳性神经元/细胞的幼虫。

6. 体内 树突成像

1. 将幼虫放入凹面载玻片中，加入少量80%甘油。盖上盖玻片以固定幼虫，确保幼虫与盖玻片之间无气泡残留。
2. 轻轻推动盖玻片，使幼虫缓慢滚动，以便观察目标神经元。通过共聚焦显微镜对mCD8::GFP标记的树突分支进行成像。

7. 幼虫解剖

开始前注意事项： 多巴胺能神经元树突在解剖开始后会迅速退化。每只幼虫的解剖操作应在5分钟内完成，以确保树突形态良好。

1. 在Sylgard培养皿上解剖游走期3^rd龄幼虫，方法如前所述³⁴，但作如下修改：
   1. 若需成像多巴胺能神经元轴突末端，应确保中枢神经系统（CNS）完整，节间神经未断裂。打开幼虫体壁后，首先小心剪断气管与体壁之间的连接，然后轻柔地移除整个肠道。
   2. 若仅对树突进行成像，可移除中枢神经系统，以便获得更平整的样本封片。

8. 幼虫肌片的固定与封闭

1. 将幼虫仍固定在Sylgard板上，于室温下在含4% PFA的PBS中，在轻轻旋转的摇床上固定20分钟。
2. 固定后去除幼虫组织残留（如脂肪体、气管等）。
3. 在Sylgard板和摇床上用PBST（含0.1% Triton X-100的PBS）洗涤3次，每次10分钟。若观察轴突末端，保持肌肉展开样本留在Sylgard板上。（若染色树突，可在本步骤将幼虫展开样本转移至0.5 ml离心管中³⁴）
4. 在摇床上，于室温下用含5%正常驴血清（NDS）的PBST封闭幼虫20分钟。

9. 幼虫肌片染色

1. 移除封闭液，加入一抗（溶于5%NDS/PBST中），于4°C过夜孵育，将样品管置于小型密闭容器内，并用湿润的纸巾包裹以保持湿度。
2. 将样品管从4°C取出，在室温下继续孵育1小时。
3. 用PBST洗涤6次，每次10分钟。加入二抗（溶于5%NDS/PBST中），避光孵育以防止荧光染料发生光漂白³⁴。
4. 可在室温下孵育2小时，或在4°C过夜孵育后，再于室温孵育1小时。
5. 用PBST洗涤幼虫6次，每次10分钟，随后进行封片处理。

10. 幼虫肌瓣用于树突分支观察的制片

1. 使用解剖剪或解剖刀将每条幼虫肌片尽可能平展地固定，切去头部（包括口钩）和尾部（包括气门）³⁴。
2. 将幼虫肌片置于载玻片上，表皮面朝下，用80%甘油封片，并用指甲油密封盖玻片边缘，制成“快速”封片标本³⁴。
3. 如需永久封片并获得更清晰的图像
   1. 将解剖好的幼虫肌片肌肉面朝下放置在经多聚赖氨酸（PLL）处理的盖玻片上的一滴PBS液滴中，肌片会迅速黏附于盖玻片。
   2. 封片后尽可能吸除多余液体，但切勿使其完全干燥。
   3. 将带有肌片的盖玻片依次浸入乙醇系列溶液中：35%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇，最后两次分别置于100%乙醇中，每次10分钟（第二次100%乙醇需频繁更换）；最后用二甲苯洗涤2–3次，每次10分钟。
   4. 在洁净的载玻片上滴一滴DPX封片剂（Distyrene Plasticizer Xylene），小心将盖玻片肌片面朝下覆盖其上。置于避光处，待DPX固化一天后再进行成像。

11. 幼虫肌片的制备以观察轴突末端

1. 在解剖、固定和染色过程中，保持周围神经系统（PNS）与中枢神经系统（CNS）之间的节段神经完整，以便追踪从外周感觉神经元胞体至腹神经索（VNC）的轴突。
2. 将每条幼虫的剥离体壁样本以角质层朝下的方向置于含80%甘油的凹面载玻片中。在共聚焦显微镜下追踪从DA神经元胞体至腹神经索（VNC）的轴突。注意：每个体节的体壁中的PNS神经元投射至腹神经索（VNC）的对应节段。

12. 代表性结果：

代表性结果如图3-5所示。图3展示了一个IV类da神经元的完整树突形态，已捕获 体内 在共聚焦显微镜下观察。图4显示了经免疫组织化学标记的III类神经元树突分支部分的放大图像，该样本经过正确固定以保持形态结构；插图则显示了在解剖和固定不成功时可能出现的降解现象（均使用抗GFP抗体染色）。图5显示了中枢神经系统中单个IV类轴突末端（抗GFP，绿色）；所有IV类末端均与抗CD2抗体共染（品红色）。

图 1 实验方案概览。a) 收集胚胎并进行热激处理。b) 选取具有GFP阳性DA神经元克隆的幼虫，对活体幼虫中GFP标记的树突分支进行成像。c) 解剖幼虫，随后对肌肉组织进行免疫组织化学染色。d) 将染色后的肌肉组织装片，然后对DA神经元克隆的树突分支及轴突投射进行成像。

图 2 为热激准备苹果汁琼脂平板。取该平板（白色箭头，a-b），在其上方叠加第二个培养皿（红色箭头，b），并用封口膜（Parafilm）在周围密封（蓝色箭头，b）。

图3 体内 表达 mCD8::GFP 标记的 MARCM 克隆（基因型同 2.1）的树突分支图像，代表一只 3 龄幼虫的 IV 类（v'ada）神经元^rd 龄期幼虫。比例尺为50μm。

图 4 经抗 GFP 抗体染色的 class III 神经元（ddaA）mCD8::GFP 标记的 MARCM 克隆，显示成功解剖和固定后具有良好的形态（绿色）。插图显示解剖和固定失败后出现的树突降解现象（白色箭头，品红色）。比例尺为 25μm。

图5 3^rd 三龄幼虫腹神经索。使用抗GFP抗体（绿色）检测到单个Flp-out克隆的VI类（vdaB）轴突末端（基因型同2.2）。抗CD2抗体标记所有IV类轴突末端（紫红色）。比例尺为25μm。

讨论

Drosophila 幼虫的 DA 神经元模型为研究控制神经元形态和神经环路形成的机制提供了一个优良的遗传系统。通常使用 MARCM 技术对 DA 神经元克隆进行标记和产生。在 MARCM 实验中，我们可使用泛神经元特异性驱动子（例如 Gal4^c155）或 DA 神经元特异性驱动子。使用泛神经元驱动子时，可直接利用公共品系保藏中心广泛提供的多种果蝇品系。然而，使用 DA 神经元特异性驱动子可能更具优势，因为标记的克隆不会在中枢神经系统（CNS）中产生，而这些克隆可能会干扰对 DA 轴突末端的分析。常用的 DA 神经元特异性 Gal4 品系列表可参见 Shimono 等人（2009）²⁷。当研究人员希望同时利用 Gal4-UAS 双元系统³⁵异位表达某个基因，并在单个标记神经元中测量其形态时，Flp-out 技术可能特别有用。此外，本文所介绍的成像方案也可单独用于使用 Gal4-UAS 系统³⁵标记 DA 神经元的情况。

如果缺乏性能良好的荧光解...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SZX16 荧光解剖显微镜（配备 GFPHQ 滤光片）	Olympus Corporation	SZX16
活体昆虫镊子	Fine Science Tools	26030-10
26 mm × 76 mm 凹面载玻片	Toshinriko Co.	T8-R004
Sylgard 184（或 Silpot 184）	Dow Corning	3097358-1004
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P-1524	该产品已被证明效果最佳
DPX 封片介质	Sigma-Aldrich	44581
兔抗 GFP 抗体	Invitrogen	A-11122	稀释比例 1:500
大鼠抗 CD8 抗体	Caltag	5H10	稀释比例 1:200
小鼠抗 CD2 抗体	AbD Serotec	MCA443R	稀释比例 1:700
小鼠抗 Fasciclin2 抗体	DSHB	1D4	稀释比例 1:10