通过短暂的DMSO处理增强干细胞分化

摘要

本视频展示了通过短暂的DMSO处理促进干细胞分化的实验方法，该处理可将细胞阻滞在G1期。处理后，加入含有BMP和TGF-β抑制剂的外胚层分化培养基，以促进神经前体细胞的形成。

1. 干细胞维持

注意： 下文所述的细胞维持方案适用于以贴壁单层形式培养的多能干细胞（PSCs）。在二甲基亚砜（DMSO）处理前使用的培养基、其他试剂及细胞培养板可根据需要进行调整。本论文中所有后续实验方案均应在生物安全柜内操作处理细胞。

根据制造商说明，使用适用于多能干细胞的基质或包被物对无菌的6孔组织培养板进行包被，并在CO₂ 培养箱（5% CO₂，湿润环境）中孵育至少1小时。包被后的培养板可用封口膜密封，于4 °C保存最多一周。
在37 °C水浴中解冻冻存的PSCs。在将冻存管移入生物安全柜前，用乙醇进行表面消毒，随后立即用移液器将细胞转移至含有5–10倍体积预热干细胞培养基的无菌锥形管中。
在室温（RT）下以300 x g 离心5分钟。
吸除培养基，用1 mL添加了10 µM Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂（如Y-27632）的干细胞培养基轻柔重悬细胞沉淀。
从培养板中吸除包被基质，按所需密度接种细胞，通常每孔接种0.5–1 × 10⁶ 个细胞，每孔至少加入2 mL干细胞培养基。
注意： 不同细胞系和克隆的接种密度可能有所不同，应相应优化。
每天更换预热的干细胞培养基以维持细胞生长。当细胞融合度达到约70%–80%，或细胞集落开始相互接触时进行传代。
传代时，吸除培养基，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。每孔加入1 mL消化酶溶液，在37 °C孵育5–10分钟。
用预热的干细胞培养基洗涤并重悬细胞，转移至无菌锥形管中，加入5–10倍体积的干细胞培养基。按照步骤1.3–1.7进行细胞接种。

2. DMSO 预处理

注意： 在诱导分化前对细胞进行DMSO预处理铺板时，应根据干细胞系的典型生长速率以及所用的分化方案，优化初始铺板的细胞密度。必要时，使用常规标志物验证细胞的多能性。细胞在初次复苏后，应在分化前至少传代1至2次。

二维培养分化
1. 当细胞达到适当的汇合度时，准备包被的培养板，消化细胞并按上述方法制备单细胞悬液。
2. 使用血细胞计数板或自动细胞计数器（包括台盼蓝或其他活力标记物）对活细胞进行计数。
3. 将细胞以每孔 0.5–1 × 10⁶ 个细胞的密度接种到包被的6孔板中，培养基为含10 µM ROCK抑制剂的干细胞培养基。
  注意： 对于本实验室测试的细胞系，该密度通常在24小时DMSO预处理后达到80%–90%的汇合度。
4. 将细胞在37 °C、CO₂ 培养箱（5% CO₂，湿润环境）中孵育24小时。
5. 在预热的干细胞培养基中配制1%–2%的DMSO溶液（例如，10 mL培养基中加入100 µL DMSO = 1% DMSO溶液，或10 mL培养基中加入200 µL DMSO = 2% DMSO溶液）。
6. 孵育24小时后，吸除细胞培养基，并更换为DMSO溶液。
7. 在分化前，将细胞继续在37 °C、CO₂ 培养箱（5% CO₂，湿润环境）中孵育24至48小时。
  注意： 通常情况下，大多数人类胚胎干细胞和诱导性多能干细胞（ESC和iPSC）系经过24小时DMSO处理已足够。生长速度较慢（倍增时间较长）的细胞系可从48小时DMSO孵育中获益。对于48小时DMSO孵育，可在首次处理24小时后更换为新鲜的含1%–2% DMSO的干细胞培养基。

3. 向三胚层分化

注意： 以下所述方法为本实验室先前证实对在6孔板上以单层培养的PSCs有效的方案。在DMSO处理后，应选用任何合适的分化方案，以促进细胞向目标谱系分化。DMSO处理24–48小时后，移除DMSO溶液，并依照标准方案继续进行分化。

外胚层分化
1. 使用DMSO按照上述二维培养的方法对细胞进行预处理。
2. 配制 Noggin 和 SB431542 储存液。
3. 通过将 knockout 血清替代物（KOSR）溶解于 knockout DMEM 培养基中，配制终浓度为 10% 的外胚层分化基础培养基。
  注意： 准备足够用于3至4天换液的基础培养基。
4. 通过将Noggin加入预热的KOSR/knockout DMEM中，使其终浓度为500 ng/mL，再加入SB431542使其终浓度为10 µM，配制外胚层分化培养基。
5. DMSO 预处理后，吸除细胞培养液，更换为分化培养基（例如，每孔 2 mL，6 孔板）。
6. 将细胞置于37 °C的CO₂培养箱中孵育3-4天₂ 培养箱（5% CO₂）₂，湿润的环境），每天更换培养基并添加新鲜的分化因子。

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