从成年大鼠脊髓室管膜下区分离神经干细胞前体细胞

摘要

来源：Mothe, A.，等，从成年大鼠和人脊髓室管膜下区分离神经干细胞/前体细胞。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频介绍了一种从成年大鼠脊髓室管膜下组织中分离神经干细胞/前体细胞的方法。该技术包括将组织碎片置于含有蛋白水解酶的溶液中孵育，以破坏细胞外基质并释放细胞。随后，将释放的细胞接种于含有特定生长因子的培养基中，以促进神经干细胞/前体细胞的增殖，并诱导其聚集成三维神经球。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 解剖缓冲液与培养基的制备

1. 为分离大鼠脊髓，准备 100 ml 解剖缓冲液（1× PBS + 0.6% 葡萄糖 + 2% 青霉素-链霉素），并置于冰箱中冷藏。
2. 准备 100 ml 无血清培养基（SFM），并在 37 °C 预热。配制 SFM 时，将 2 mM L-谷氨酰胺、100 μg/ml 青霉素-链霉素、2% B27 和 10% 激素混合物加入 Neurobasal-A 培养基中。配制激素混合物时，使用 1:1 的 DMEM/F12 培养基，其中包含 0.6% 葡萄糖、3 mM NaHCO₃、5 mM HEPES、25 μg/ml 胰岛素、100 μg/ml 脱铁转铁蛋白、10 μM 腐胺、30 nM 硒和 20 nM 孕酮。
3. 配制 EFH 生长因子富集的铺板培养基（在 SFM 中加入 20 ng/ml EGF、20 ng/ml bFGF 和 2 μg/ml 肝素），并在 37 °C 预热。

2. 成年大鼠室管膜周围脊髓组织的收获与解剖

1. 将解剖器械在乙醇中消毒，并用无菌生理盐水冲洗，或提前进行高压灭菌。根据所在机构批准的动物实验方案，对大鼠（6–8周龄）注射致死剂量的戊巴比妥钠（65 mg/ml，1 cc）或过量麻醉剂（如4%异氟烷）。用70%乙醇润湿大鼠背部，再用大型解剖剪刀去除背侧皮肤。
2. 将剪刀垂直于背侧表面，在后肢上方横向剪断椎体。使用较小的剪刀沿椎体上方的背侧肌肉纵向向头侧方向切开，以暴露棘突。
3. 从暴露的尾端开始，将咬骨钳或小型钝性骨剪经硬膜外插入椎管侧方，置于脊髓与椎体之间的间隙。对椎板（位于每节椎骨棘突左右两侧的骨性弓状结构）进行小范围切割，并小心剥离椎板以暴露脊髓（图1A-D）。确保器械刀刃角度平缓且与脊髓平行，避免损伤下方的脊髓组织。
4. 继续向头侧方向进行椎板切除术，以暴露胸段和颈段脊髓。
5. 用钝头组织镊子轻轻将脊髓从椎体中取出，并使用显微剪刀小心切断神经根以释放脊髓。将取出的脊髓置于含有4 °C无菌大鼠解剖缓冲液（如上文1.1所述）的培养皿中。用新配制的4 °C解剖缓冲液冲洗组织，并用剪刀将脊髓横向切成1 cm长的节段（图1E）。
6. 对每个组织节段，用一只手以精细镊子夹持组织，另一只手在解剖显微镜辅助下，用显微剪刀小心去除覆盖其上的软脑膜、白质以及大部分灰质。或者，也可使用精细镊子（Dumont #4）剥离大部分灰质和白质，仅保留脊髓的室管膜周围区域，包括室管膜及其周围少量灰质组织（图1F-H）。
7. 将分离得到的室管膜周围组织收集至一个含有冷的大鼠解剖缓冲液的10 cm无菌培养皿中。

3. 成年大鼠脊髓NSPCs的分离与培养

1. 在超净工作台中无菌操作执行以下步骤。
   1. 用显微剪将分离的大鼠室管膜周围组织剪切成约 1 mm 的小块。
   2. 使用材料/试剂表中列出的木瓜蛋白酶解离试剂盒，通过蛋白水解酶对剪碎的组织进行酶解解离。
      注意：试剂组分包括四个小瓶：小瓶 1：Earle's 平衡盐溶液（EBSS）；小瓶 2：含 L-半胱氨酸和 EDTA 的木瓜蛋白酶；小瓶 3：脱氧核糖核酸酶 I（DNase）；小瓶 4：含牛血清白蛋白（BSA）的卵黏蛋白蛋白酶抑制剂。
      注意：木瓜蛋白酶是一种巯基蛋白酶，对多种蛋白质底物具有广泛的特异性。此处所用的木瓜蛋白酶来源于番木瓜（Carica papaya）植物的乳胶，其对大多数蛋白质底物的降解作用比胰蛋白酶更广泛。在解离过程中，部分细胞会受损并释放 DNA 到解离液中，导致液体黏度升高，影响移液操作。因此，在细胞分离过程中加入 DNase 以消化游离 DNA，同时不损伤完整细胞。卵黏蛋白是一类糖蛋白类蛋白酶抑制剂，用于在解离步骤后抑制木瓜蛋白酶的活性。
2. 首次使用时，将卵黏蛋白-白蛋白抑制剂混合物（小瓶 4）用 32 ml EBSS（小瓶 1）重悬，随后于 4 °C 保存，供后续分离使用。注意：该操作可获得每毫升含 10 mg 卵黏蛋白抑制剂和 10 mg 白蛋白的溶液。
3. 向木瓜蛋白酶小瓶（小瓶 2）中加入 5 ml EBSS（小瓶 1），配制成每毫升含 20 单位木瓜蛋白酶、1 mM L-半胱氨酸和 0.5 mM EDTA 的溶液。检查木瓜蛋白酶溶液是否完全溶解并呈澄清状态；若未完全溶解，将小瓶置于 37 °C 水浴中 10 分钟，直至木瓜蛋白酶完全溶解，以确保酶的总活性。
4. 向 DNase 小瓶（小瓶 3）中加入 500 μl EBSS（小瓶 1），轻轻混匀，避免剪切力导致 DNase 变性。再向木瓜蛋白酶小瓶中加入 250 μl DNase 溶液，最终浓度约为 20 单位/ml 木瓜蛋白酶和 0.005% DNase。剩余 DNase 溶液保留，以备后续使用。
5. 将剪碎的大鼠组织放入木瓜蛋白酶溶液中。
6. 于 37 °C 在摇床上持续振荡孵育，利用活化的木瓜蛋白酶溶液解离组织。大鼠组织孵育时间为 45 分钟至 1 小时。
7. 用 10 ml 移液器反复吹打混合液，以解离残留的组织块，获得混浊的细胞悬液。将细胞悬液（避免转移未解离的组织块）转移至无菌 15 ml 圆底离心管中，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
8. 将细胞沉淀重悬于含卵黏蛋白（木瓜蛋白酶抑制剂）的培养基中。
   1. 在 15 ml 圆底离心管中，将 2.7 ml EBSS（小瓶 1）与 300 μl 重悬后的白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液（小瓶 4）混合，制备卵黏蛋白溶液。再加入 150 μl DNase 溶液（小瓶 3）。
   2. 弃去细胞沉淀的上清液，立即用稀释后的含 DNase 白蛋白-抑制剂混合液重悬细胞沉淀。
9. 通过单步不连续密度梯度离心，将完整细胞与细胞膜碎片分离。
   1. 在 15 ml 离心管中加入 5 ml 白蛋白-抑制剂溶液（小瓶 4），再用 5 ml 移液器将上述制备的细胞悬液缓慢、轻柔地叠加于白蛋白-抑制剂溶液之上。
   2. 在室温下以 70 × g 离心 6 分钟。
      注意：梯度两层之间的界面应清晰可见，尽管界面处轻微混合不影响实验结果。膜碎片停留在界面处，而解离的细胞则沉淀至管底。
10. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 ml 预热至 37 °C 的大鼠 EFH 培养基中。用血细胞计数板计数活细胞密度，并以 10 个细胞/μl 的密度将细胞接种至 T25 培养瓶中。从大鼠组织中通常可获得约 2 × 10⁶ 个细胞，细胞活力约为 80%。若需获得克隆化培养物，可将细胞以低于 10 个细胞/μl 的密度接种。将培养瓶置于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养，静置培养 1 周，避免细胞球体聚集。

结果

图1. 大鼠脊髓的椎板切除与室管膜周围区域的解剖。 (A) 在暴露的脊髓尾端，使用咬骨钳从椎管侧方经硬膜外插入。 (B) 在椎骨两侧的椎板上做小切口，并小心剥离椎板以暴露脊髓。 (C) 椎板切除后暴露的颈段脊髓。 (D) 胸椎横切面示意图，显示脊髓及椎板切除时的切割位置（以红色虚线表示）。椎板和棘突（阴影区域）被移除。 (E) 将脊髓横向切成1 cm长的节段。 (F) 使用显微剪小心去除覆盖的脑膜、白质以及大部分灰质。 (G)

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1× PBS	Life Technologies	#10010023	解剖缓冲液
1× HBSS	Life Technologies	#14175095	解剖缓冲液
D-葡萄糖	Sigma	# G-6152	为解剖缓冲液和激素混合液配制30%葡萄糖储备溶液
青霉素-链霉素	Life Technologies	#15140-148	解剖缓冲液和培养基
Neurobasal-A	Life Technologies	#10888-022	培养基
L-谷氨酰胺，200 mM	Life Technologies	#25030-081	培养基
B27	Life Technologies	#12587010	培养基
DMEM	Life Technologies	#11885084	激素混合物
F12	Life Technologies	#21700-075	激素混合物
NaHCO₃3	Sigma	# S-5761	配制用于激素混合液的7.5% NaHCO3储备液
HEPES	Sigma	#H9136	配制用于激素混合液的1 M HEPES储存液
胰岛素	Sigma	#I-5500	激素混合物
脱铁转铁蛋白	Sigma	#T-2252	激素混合物
腐胺	Sigma	# P7505	激素混合物
硒	Sigma	#S-9133	激素混合物
孕酮	Sigma	#P-6149	激素混合物
EGF，小鼠	Sigma	#E4127	在 B27 中配制 100 μg/ml 储存液并分装；EFH 培养基
bFGF，人重组	Sigma	#F0291	在 B27 中配制 100 μg/ml 储存液并分装；EFH 培养基
肝素，10,000 U	Sigma	#H3149	在激素混合液中配制27.3 mg/ml的母液并分装；EFH培养基
木瓜蛋白酶解离试剂盒	沃辛顿生化公司	#LK003150	含 EBSS、木瓜蛋白酶、DNase、含 BSA 的卵黏蛋白蛋白酶抑制剂
戊巴比妥钠	Bimeda – MTC 动物健康公司	DIN 00141704
组织镊：Addison 镊	Fine Science Tools	#11006-12	锯齿状标准尖端；也可提供微尖
精细镊子：Dumont #4	Fine Science Tools	#11241-30
显微剪刀	Fine Science Tools	#15024-10	圆柄万能剪
骨钳	Bausch & 伦布	N1430
10 mm 培养皿	Nunc	1501
T25 培养瓶	Nunc	156367
6孔板	Nunc	CA73520-906