分离与培养小鼠脑部周细胞

摘要

来源：Mehra, A.，等，一种从小鼠脑组织中高效分离脑周细胞的方法。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种从小鼠脑组织中分离脑周细胞的方法。分离得到的细胞在周细胞特异性培养基中进行培养，以促进周细胞的增殖。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 溶液的配制

1. 配制500 mL洗涤缓冲液A（WBA）：含10 mM HEPES的Hank's平衡盐溶液（HBSS）。4 °C保存。
2. 配制500 mL洗涤缓冲液B（WBB）：含0.1%牛血清白蛋白（BSA）和10 mM HEPES的HBSS溶液。4 °C保存。
3. 在室温下将葡聚糖溶液与WBA混合过夜，配制300 mL含30%葡聚糖的WBA溶液。使用前于110 °C高压灭菌30分钟。灭菌后，将溶液在室温下静置2–3小时。4 °C保存。
4. 在预冷的葡聚糖溶液中配制100 mL含0.1% BSA的溶液。剧烈震荡3–4分钟，4 °C保存。
5. 通过将20%小牛血清、2 mM谷氨酰胺、50 µg/mL庆大霉素、1%维生素、2% Eagle基础氨基酸溶液（BME）溶解于基础DMEM培养基中，配制完全的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）培养液，4 °C保存。使用前加入1 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。
6. 在周细胞培养基础培养基中加入周细胞生长添加剂（随周细胞培养基提供）和20%胎牛小牛血清（FCS），配制完全的周细胞培养基，4 °C保存。

2. 脑组织回收与脑膜去除

1. 为保证一致性，每次提取应使用年龄相近、性别相同的小鼠。使用无病原体动物饲养环境，并提供自由饮水。为确保实验效率并减少动物使用量，应避免组织材料的损失。
2. 处死4-6周龄雄性C57BL/6J小鼠（Janvier labs, Le Genest-Saint-Isle, France）。
3. 在无菌条件下迅速取出脑组织，避免对组织造成任何损伤。将组织小心放入40 mL冷磷酸盐缓冲液（PBS）中。
4. 将含有脑组织的冷PBS转移至培养皿（100 mm x 15 mm）中。
5. 将脑组织置于无菌无绒擦拭纸上，用弯头镊子去除小脑、纹状体和枕叶神经。
   1. 用棉签清除所有可见的脑膜。将脑组织倒置，用棉签由内向外轻轻划动以展开脑叶，并清除所有可见的血管。
   2. 将去除了脑膜的脑组织放入含15 mL冷WBB的培养皿（100 mm x 15 mm）中。

3. 匀浆化

1. 用镊子将组织转移至Dounce组织研磨器的研磨管中，并加入3-4 mL WBB。
2. 先用“松”研棒研磨组织55次，用WBB冲洗“松”研棒；再用“紧”研棒将匀浆研磨25次。
3. 将匀浆平均分装至两个50 mL离心管中，每管加入1.5倍体积的预冷30% BSA-葡聚糖溶液，剧烈振荡混匀。

4. 血管组分的分离

1. 剧烈振荡试管后，在 4 °C 条件下以 3,000 × g 离心 25 分钟。
2. 将上清液（连同顶部的髓鞘层）转移至 2 个新试管中，并在 4 °C 条件下以 3,000 × g 离心 25 分钟。保留第一次离心所得的沉淀，加入 3 mL 冷 WBB（将沉淀置于 4 °C 保存）。
3. 重复步骤 4.2，并小心保留第二次离心所得的沉淀。
4. 弃去步骤 4.3 中试管内的葡聚糖、髓鞘及组织碎片，将沉淀保存在冷 WBB 中。
5. 合并步骤 4.1 中试管 1 和试管 2 的内容物，并用冷 WBB 定容至 10 mL。
6. 对步骤 4.2 和步骤 4.3 所得的试管重复此操作。
   注：最终得到来自三次离心的 3 个试管。
7. 使用 10 mL 移液器上下吹打 6 次以重悬沉淀，直至无可见沉淀团块。
8. 使用真空过滤装置和尼龙网滤器过滤每个试管中的细胞悬液。
   注：此过滤步骤至关重要，可通过滤网去除较长或较大的血管结构。
9. 用平头镊子或刮刀在室温 WBB 中轻轻刮取滤膜，回收并重悬毛细血管。使用新的滤器再次过滤悬液，以回收更多毛细血管。
10. 将滤液均分为两份，分别加入两个试管中，在室温下以 1,000 × g 离心 7 分钟。
    注：在此离心过程中，准备酶解液。根据所用动物数量确定所需 WBB 体积（见材料表）。在 WBB 中加入 1× DNase 1 和 1× 甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲烷盐酸盐（TLCK）（见材料表），并预热至 37 °C。
11. 将步骤 4.10 所得沉淀收集至一个试管中，加入含酶的预热 WBB，再加入预热的 1× 胶原酶/分散酶。将试管置于 37 °C 摇床水浴中，精确孵育 33 分钟。
12. 加入 30 mL 冷 WBB 终止酶反应。将悬液在室温下以 1,000 × g 离心 7 分钟。
13. 小心弃去上清液，使用 10 mL 移液器在 WBB 中上下吹打 6 次以重悬沉淀。此步骤应较轻柔且速度相对较快。
14. 将悬液在室温下以 1,000 × g 离心 7 分钟。
    注：在此步骤期间，弃去培养皿的包被液，并用室温 DMEM 冲洗一次。在室温下对细胞培养皿进行包被，至少孵育 1 小时。
15. 弃去步骤 4.14 所得试管中的上清液，将沉淀重悬于新鲜的完全 DMEM 培养基中，接种细胞（第 0 天，P0），每 6 孔板接种 9 个孔（每个孔面积为 9.6 cm²）。

5. 脑周细胞的增殖

1. 将细胞培养物置于无菌培养箱中，37 °C、5% CO₂ 条件下培养。接种细胞后 24 小时（第 1 天），小心去除碎片并更换培养基。自第 1 天起，每 48 小时更换一次培养基。
2. 观察细胞培养至少 7–8 天。此时，内皮单层上方的细胞生长应可见。
3. 在第 8–10 天（根据融合度而定）将细胞以周细胞培养基传代至明胶包被的培养皿中，记为第 1 代（P1）。每 2 天更换一次培养基。继续观察细胞 6–7 天。根据需要，在第 17 天连续传代至第 2 代（P2）[仅在需要时于第 24 天传代至第 3 代（P3）]，并在明胶包被的培养皿中使用周细胞培养基进行培养。
   注意：细胞在融合度达到约 80–90% 时即可用于实验或观察。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨基酸 BME	Sigma	B-6766	4 °C 下保存。
基础 DMEM 培养基	Invitrogen	316000083	4 °C 下保存。
碱性成纤维细胞生长因子	Sigma	F-0291	-20 °C 下保存。
BSA	Sigma	A-8412	4 °C 下保存。
胶原酶-分散酶	Sigma	10269638001	用无菌 PBS-CMF 配制 10 倍储存液。使用 0.22 μm 注射器滤器过滤溶液，并于 -20 °C 保存。注意：在实验方案的酶消化步骤中，每提取 10 只小鼠的组织需使用 300 µL 的 10 倍浓度胶原酶-分散酶。
葡聚糖	Sigma	31398
DNase I	Sigma	11284932001	将 100 mg 溶于 10 mL 无菌水中，配制成 1000 倍储存液，并于 -20 °C 保存。
明胶	Sigma	G-2500	通过将明胶溶于无菌 PBS-CMF（8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，0.2 g/L KH2PO4，2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O)，pH 7.4）中配制 0.2% 的工作包被液。在 120 °C 下高压灭菌至少 20 分钟，并于室温保存。培养皿需在 4 °C 下包被至少 4 小时。
庆大霉素	Biochrom AG	A-2712	4 °C 下保存。
谷氨酰胺	Merck	I.00289	-20 °C 下保存。
HBSS	Sigma	H-8264	4 °C 下保存。
HEPES	Sigma	H-0887	4 °C 下保存。
Matrigel	BD Biocoat	354230	将 Matrigel 储存液用冷 DMEM 按 1:48 比例稀释，配制成工作包被液，最终浓度为 85 µg/cm²。细胞培养皿应在室温下包被至少 1 小时。
周细胞培养基-小鼠	Sciencell 研究实验室	1231	4 °C 下保存。
甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮	Sigma	T-7254	将 16 mg 溶于 10.88 mL WBA 中，配制成 4 mM 的 1000 倍储存液，并于 4 °C 保存。
维生素	Sigma	B-6891	-20 °C 下保存。
过滤工具	Sefar，尼龙网，60 微米孔径
实验设备	水平转子离心机
带振荡器的水浴锅
层流罩：BSL2
玻璃器皿（所有组件均需热力灭菌）	玻璃匀浆器（带玻璃研杵）
研杵 I：0.0035 - 0.0065 英寸
研杵 II：0.0010 - 0.0030 英寸
带粗孔径烧结玻璃滤板支撑底座的真空过滤装置