来源：Trujillo, M.，等。小鼠脑海马组织的机械与酶解联合解离方法。J. Vis. Exp. (2021)
本视频演示了一种通过结合自动化的机械解离和多种酶混合物以辅助酶消化的方法，从小鼠脑海马区获得高活性单细胞悬液的实验方案。
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方法文章
从小鼠海马组织获取单细胞悬液
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物样本的操作均已经过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。
1. 为每个样品制备酶混合液1和2
注意：对于大于 2 mL 的体积，使用 10 mL 移液管；对于 200 µL–2 mL 的体积，使用 1000 µL 移液器；对于 21–199 µL 的体积，使用 200 µL 移液器；对于 2–20 µL 的体积，使用 20 µL 移液器；对于小于 2 µL 的体积，使用 0–2 µL 移液器。
- 每个样本分别在室温下解冻一份酶P和一份酶A。
- 配制酶混合液1：将50 µL酶P与1900 µL缓冲液Z加入已标记的C管中（材料表）。
- 配制酶混合液2：将20 µL缓冲液Y加入已解冻的10 µL酶A中。
2. 成年小鼠脑组织解离方案
注意：处理样本时，除非另有说明，应将试管置于室温下的试管架中，而 BSA 和 D-PBS 应保持在冰上。
- 打开组织解离仪。
- 使用镊子将海马组织块转移至C管中。
- 向C管中加入30 µL酶混合液2。旋转管盖直至感到阻力，然后继续拧紧直至发出咔嗒声。
- 将C管倒置放入解离仪的指定位置；样品将被标记为“已选”状态（图1）。将加热模块固定在C管上方。
- 按下文件夹图标，选择“Favorites”文件夹，滚动并选择37C_ABDK_02程序。点击“OK”将该程序应用于所有已选C管，然后点击“Start”开始运行（图1）。
- 为每个样品标记一个50 mL离心管。
- 在每个50 mL离心管上放置一个70 µm细胞滤网，并用2 mL BSA缓冲液润湿。
- 程序完成后，从解离仪上取下加热模块和C管。
- 向样品中加入4 mL BSA缓冲液，并将混合液转移至50 mL离心管上的细胞滤网上。
- 向C管中加入10 mL D-PBS，盖紧管盖，轻轻摇晃溶液，然后将其转移至50 mL离心管上的细胞滤网上。
- 弃去细胞滤网和C管。将悬液在4°C下以300 × g 离心10分钟，随后吸除并弃去上清液。
3. 去除碎片
- 用1550 µL冷的D-PBS重悬沉淀，并将悬液转移至已标记的15 mL锥形管中。
- 加入450 µL冷的去碎片溶液，轻轻吹打混匀（切勿涡旋混合）。
注意：去碎片溶液为商用成年动物脑组织解离试剂盒中的组分。 - 沿锥形管管壁缓慢轻柔地在细胞悬液上层叠加1 mL冷的D-PBS。重复此操作，直至总叠加体积达到2 mL。
注意：此步骤至关重要，需熟练且精准操作。 - 在4°C条件下，以3000 × g离心10分钟，加速度和刹车均设为最大。
注意：若各相未清晰分离，需重复步骤7.2–7.3。最后以1000 × g在4°C离心10分钟。 - 此时悬液应分为三层清晰的液层（图2）。吸除最上层液体，来回扫动移液器吸头以吸除中间白色层。尽可能去除中间层，同时避免扰动最底层。
注意：此步骤至关重要，需熟练且精准操作。 - 加入2 mL冷的D-PBS，吹打混匀。
- 在4°C条件下，以1000 × g离心10分钟，加速度和刹车均设为最大。吸除并弃去上清液。将沉淀重悬于1 mL BSA缓冲液中。
注意：此时可将细胞重悬于适当的缓冲液中，随后进行磁性标记与分离，为单细胞测序做准备。
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结果
图 1：第 2.4 步中的已选状态
图 2：步骤 3.5 中的三层悬浮液：缓冲液（上层）、细胞碎片、去碎片溶液和细胞（下层）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix，多种颜色 |
| 15 mL Falcon 管 | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | 聚苯乙烯 |
| 25 mL 血清移液管 | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 70 μm 细胞筛 | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 成年动物脑组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | 包含酶P、缓冲液Z、缓冲液Y、酶A、缓冲液A、去碎片溶液 |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| Falcon 50 mL 圆锥形离心管 | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| gentleMACS C 管 | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| 带加热模块的 gentleMACS Octo 组织解离仪 | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| 玻璃烧杯 | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| 移液器吸头 GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| 移液器吸头 GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| 移液器吸头 RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
| 带盖圆形冰桶 | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| 带细胞筛帽的圆底管 | Falcon | 100-0087 |
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