制备小鼠脑组织中免疫细胞的单细胞悬液

摘要

来源：DiSano, K. D., 等. 分离中枢神经系统组织及其相关脑膜以进行免疫细胞的下游分析。J. Vis. Exp. (2020)。

该视频展示了从小鼠脑组织制备免疫细胞单细胞悬液的过程。首先通过酶消化法将细胞从脑组织中释放出来，随后利用密度梯度离心法根据细胞密度分离免疫细胞，从而获得单细胞悬液。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 准备脑和脊髓组织的单细胞悬液

1. 将含有组织的培养基从离心管中倒入100 mm培养皿顶部，转移脑或脊髓组织。用镊子将组织移至培养皿底部。用无菌剃刀刀片将脑或脊髓组织切碎。用剃刀刀片轻轻刮取，将切碎的组织收集并移至培养皿底部。
   注意： 在以下酶消化方案中，最多可将两条脊髓合并处理。脑组织应单独处理。
2. 使用5 mL血清移液管，向培养皿中加入3 mL RPMI（Roswell Park Memorial Institute培养基（含10%胎牛血清（FCS））。使用10 mL血清移液管反复吹打，使组织在培养基中重悬，然后转移至15 mL锥形管中。
   注意： 如果下游应用为单细胞或批量RNA测序分析或细胞培养，应测试FCS批次，以确保细胞在分析前未被激活。或者，可使用含0.04% BSA的1×PBS替代含10% FCS的RPMI进行细胞处理。
3. 使用10 mL刻度移液管，用额外的2 mL培养基冲洗培养皿，以收集任何残留组织，并转移至锥形管中，总体积为5 mL。在处理步骤之间将试管置于冰上保存。
4. 使用移液器将胶原酶I粉末用Hank's平衡盐溶液（HBSS）培养基重悬，以获得所需浓度（例如，100 mg/mL）。将....

结果

图1：中枢神经系统组织中CD45hi浸润性免疫细胞的鉴定。（A）在假手术处理（红色）或TMEV-IDD（蓝色）小鼠脊髓的全部活细胞中，鉴定CD45hi浸润性免疫细胞（P1）、CD45lo小胶质细胞（P2）以及CD45-的少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的设门策略。在假手术处理的小鼠脑和脊髓中仅检测到极少量CD45hi细胞。（B）在TMEV-IDD小鼠的CD45hi浸润性免疫细胞（P1）中鉴定CD19+ B细胞和CD4+ T细胞的设门策略。脑和脊髓组织的设门策略相似。（C）在假手术处理（红色）和慢性TMEV-IDD小鼠（蓝色）脑膜中鉴定CD45hi细胞（P1）的设门策略。（D）在慢性TMEV-IDD小鼠脑膜的CD45.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白	ThermoFisher Scientific	37002D
离心机	Beckman Coulter	Allegra X-12R centrifuge
胶原酶 I	Worthington	LS004196
锥形管，15 mL	VWR	525-1069
锥形管，50 mL	VWR	89039-658
盖玻片	Hauser Scientific	5000
弯头镊子	Fine Science Tools	11003-14
一次性聚苯乙烯管，14 mL	Fisher Scientific	14-959-1B
脱氧核糖核酸酶 I	Worthington	LS002139
干冰	Airgas	N/A
Durmont #7 镊子	Fine Science Tools	11271-30
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物	Amresco	0105-500g
乙醇，100%	any	N/A
带滤膜顶端的管，5 mL	VWR	352235
可固定的活力染料 780	Becton Dickinson	565388
葡萄糖	Fisher Chemical	D16-500
Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)	Corning	21-020-CV
血细胞计数板	Andwin Scientific	02-671-51B
止血钳	Fine Science Tools	13004-14
HEPES (N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)	ThermoFisher Scientific	15630080
KCl	Fisher chemical	BP366-500
KH2PO4 (无水)	Sigma Aldrich	P5655-100G
液氮	Airgas	N/A
小鼠 FC 封闭剂 (CD16/32)	Becton Dickinson	553141
Na2HPO4 (无水)	Fisher Chemical	S374-500
NaCl	Fisher chemical	S671-500
针头，25 号	Becton Dickinson	305122
正常小鼠血清	ThermoFisher Scientific	31881
尼龙网筛	VWR	352350
OCT 包埋剂	Sakura	4583
多聚甲醛，20%	Electron Microscopy Sciences	15713-S	用 1 × PBS 稀释至 4%
巴斯德吸管，9 英寸，未堵塞	Fisher Scientific	13-678-20C
PBS (1×)	Corning	21-040-CV
PE 标记的大鼠抗小鼠 CD4 抗体	Becton Dickinson	553730
PE-CF594 标记的大鼠抗小鼠 CD19 抗体	Becton Dickinson	562329
Percoll 密度梯度介质	GE healthcare	17-0891-01
PerCP-Cy5.5 标记的大鼠抗小鼠 CD45 抗体	Becton Dickinson	550994
培养皿，100 mm	VWR	353003
pH 计	Fisher Scientific	13-636-AB150
移液器辅助器	Drummond Scientific Corporation	4-000-101
移液器，200 µl	Gilson	FA10005M
移液器吸头，1 mL	USA Scientific	1111-2831
移液器吸头，200 µl	USA Scientific	1111-1816
移液器，1 mL	Gilson	FA10006M
含 DAPI 的 Prolong Diamond 封片剂	ThermoFisher Scientific	P36962
纯化的大鼠抗小鼠 CD16/CD32 抗体	Becton Dickinson	553141
兔抗小鼠 CD3 抗体 (SP7 克隆)	Abcam	ab16669
兔抗小鼠层粘连蛋白抗体	Abcam	ab11575
大鼠抗小鼠 ERT-R7 抗体	Abcam	ab51824
RPMI 1640 培养基	Corning	10-040-CV
血清学移液管，1 mL	VWR	357521
血清学移液管，10 mL	VWR	357551
血清学移液管，5 mL	VWR	357543
氢氧化钠	Fisher Scientific	S318-100
蔗糖	Fisher chemical	S5-500
手术剪刀	Fine Science Tools	14001-16
手术剪刀，超细	Roboz	RS-5882
注射器，10 mL	Becton Dickinson	302995
注射器，5 mL	Becton Dickinson	309646
台盼蓝	Gibco	15250-061