制备小鼠脑组织中免疫细胞的单细胞悬液

摘要

来源：DiSano, K. D., 等. 分离中枢神经系统组织及其相关脑膜以进行免疫细胞的下游分析。J. Vis. Exp. (2020)。

该视频展示了从小鼠脑组织制备免疫细胞单细胞悬液的过程。首先通过酶消化法将细胞从脑组织中释放出来，随后利用密度梯度离心法根据细胞密度分离免疫细胞，从而获得单细胞悬液。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 准备脑和脊髓组织的单细胞悬液

1. 将含有组织的培养基从离心管中倒入100 mm培养皿顶部，转移脑或脊髓组织。用镊子将组织移至培养皿底部。用无菌剃刀刀片将脑或脊髓组织切碎。用剃刀刀片轻轻刮取，将切碎的组织收集并移至培养皿底部。
   注意： 在以下酶消化方案中，最多可将两条脊髓合并处理。脑组织应单独处理。
2. 使用5 mL血清移液管，向培养皿中加入3 mL RPMI（Roswell Park Memorial Institute培养基（含10%胎牛血清（FCS））。使用10 mL血清移液管反复吹打，使组织在培养基中重悬，然后转移至15 mL锥形管中。
   注意： 如果下游应用为单细胞或批量RNA测序分析或细胞培养，应测试FCS批次，以确保细胞在分析前未被激活。或者，可使用含0.04% BSA的1×PBS替代含10% FCS的RPMI进行细胞处理。
3. 使用10 mL刻度移液管，用额外的2 mL培养基冲洗培养皿，以收集任何残留组织，并转移至锥形管中，总体积为5 mL。在处理步骤之间将试管置于冰上保存。
4. 使用移液器将胶原酶I粉末用Hank's平衡盐溶液（HBSS）培养基重悬，以获得所需浓度（例如，100 mg/mL）。将I型胶原酶加入含有剪碎组织样本的锥形管中，以达到所需的终浓度（例如，1 mg/mL时加入50 µL）。
   注意： 较高浓度的胶原酶可提高细胞得率，但可能切割细胞表面标志物。因此，应进行胶原酶I批号的滴定，以确定获得最多活细胞且所有必需细胞表面标志物保持完整的最佳浓度。例如，在单个脑组织或脊髓样本上测试了终浓度分别为0.5 mg/mL、1 mg/mL和2 mg/mL的胶原酶I。通过台盼蓝排斥法检测细胞活力，并通过流式细胞术评估细胞表面标志物CD45、CD19和CD4的表达。结果显示，1 mg/mL的胶原酶I浓度可获得最高的活细胞数，同时保留所有目标细胞表面标志物。因此，后续针对这些细胞类型的实验均采用该浓度。
5. 轻轻用0.15 M氯化钠溶解DNase I粉末，配制成所需储存浓度。将重悬的DNase I加入含有剪碎组织样本的锥形管中，使其终浓度为20 U/mL。
   注意： DNase I 不同批次的活性单位每毫升存在差异。根据原液每毫升的活性单位，需调整加入组织样本中的浓度。每个样本的最终目标浓度为 20 U/mL。
6. 将试管放入37 °C水浴中的试管架内，孵育40分钟。每15分钟颠倒混匀一次，使组织与酶充分混合。孵育结束后，向每支试管中加入500 µL 0.1 M EDTA（pH = 7.2），使EDTA终浓度为0.01 M，再继续孵育5分钟以灭活胶原酶。
7. 使用 10 mL 血清移液管，向每根试管中加入 9 mL 添加了 10% FCS 的 RPMI，使每根试管的总体积达到约 14.5 mL。在 450 x g 在 4 ˚C 下离心 5 分钟。使用连接真空泵的巴斯德吸管小心吸去上清液，注意不要触碰细胞沉淀。
8. 使用5 mL血清移液管，向含有细胞沉淀的离心管中加入3 mL 100%储备等渗密度梯度溶液。使用10 mL血清移液管，加入额外的RPMI 10% FCS培养基，使最终体积达到10 mL，并重悬细胞沉淀，形成30%储备等渗密度梯度溶液层。
   注意： 提前配制100%储存用等渗密度梯度介质，分装后于4 °C保存，可稳定存放长达3个月。配制100%储存用等渗密度梯度溶液时，将密度梯度介质（材料表) 用密度梯度介质稀释缓冲液。配制密度梯度介质稀释缓冲液（80.0 g/L NaCl，3.0 g/L KCl；0.73 g/L Na₂HPO₄，0.20 g/L KH₂PO₄；20.0 g/L 葡萄糖），使用真空过滤系统过滤除菌。通过将1份密度梯度稀释缓冲液与9份密度梯度介质混合，配制100%储存液的等渗密度梯度溶液，充分混匀。
9. 在加入70%储备等渗密度梯度溶液作为底层液之前，先将每支试管倒置并充分混匀。将一支含有1 mL 70%储备等渗密度梯度溶液的1 mL血清学移液管插入试管底部。缓慢地将1 mL该溶液作为底层液加入，注意避免产生气泡。然后缓慢取出移液管，注意不要破坏形成的密度梯度。
   注意： 对于70%的底层液，应使用RPMI培养基将100%的等渗密度梯度溶液稀释至70%（即取7 mL 100%等渗密度梯度溶液与3 mL RPMI培养基充分混合）。此外，制备一层清晰且未受扰动的70%底层液，对于去除髓鞘碎片以及在离心后从梯度界面获得纯净的单细胞悬液至关重要。
10. 800 x g 离心 g 4 °C 下离心 30 分钟，不启用刹车。吸除上清液，包括髓鞘碎片层，保留管底 2–3 mL 液体，注意勿扰动细胞层。用 1 mL 移液器收集 30/70% 密度梯度间的细胞层，并转移至新的 15 mL 无菌锥形离心管中。
11. 使用10 mL血清移液管加入RPMI 10% FCS培养基，使最终体积达到15 mL。离心450 x g 4 °C下离心5分钟。
    注意： 在此步骤中，如有需要，可将两个试管中的细胞层合并。切勿合并超过两个试管，否则会因高密度梯度培养基浓度过高而导致细胞无法形成沉淀。
12. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。用适当体积的缓冲液重悬细胞，以便使用血细胞计数板进行细胞计数（例如，将一条脊髓组织重悬于 250 µL FACS 缓冲液中，用于后续表面染色）图1).
13. 使用1 mL移液器，将细胞悬液转移至带滤膜的上样管顶部（材料列表）并让细胞沉降至管底，以去除残留的髓鞘碎片。
14. 使用台盼蓝排斥染料，稀释后在血细胞计数板上计数细胞，为确保准确性，至少取两个16方格区域的平均值40,41。
15. 采用所需的单细胞分析技术进行后续操作。
    注意： 使用不同类型的胶原酶（如胶原酶D、I型、II型、IV型）、免疫细胞、小胶质细胞（图1)，星形胶质细胞、周细胞、内皮细胞49和神经元50均可被高效分离。使用滴定后的胶原酶I酶处理所得的有核细胞计数结果如下：完整假手术处理脑组织 = 500,000–600,000 个细胞；完整TMEV-IDD脑组织 = 800,000–1,000,000 个细胞；完整假手术处理脊髓 = 150,000–200,000 个细胞；完整TMEV-IDD脊髓 = 300,000–400,000 个细胞。细胞计数结果会因样本采集与处理的精确程度以及中枢神经系统是否存在炎症而有所差异。

结果

图1：中枢神经系统组织中CD45hi浸润性免疫细胞的鉴定。（A）在假手术处理（红色）或TMEV-IDD（蓝色）小鼠脊髓的全部活细胞中，鉴定CD45hi浸润性免疫细胞（P1）、CD45lo小胶质细胞（P2）以及CD45-的少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的设门策略。在假手术处理的小鼠脑和脊髓中仅检测到极少量CD45hi细胞。（B）在TMEV-IDD小鼠的CD45hi浸润性免疫细胞（P1）中鉴定CD19+ B细胞和CD4+ T细胞的设门策略。脑和脊髓组织的设门策略相似。（C）在假手术处理（红色）和慢性TMEV-IDD小鼠（蓝色）脑膜中鉴定CD45hi细胞（P1）的设门策略。（D）在慢性TMEV-IDD小鼠脑膜的CD45...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白	ThermoFisher Scientific	37002D
离心机	Beckman Coulter	Allegra X-12R centrifuge
胶原酶 I	Worthington	LS004196
锥形管，15 mL	VWR	525-1069
锥形管，50 mL	VWR	89039-658
盖玻片	Hauser Scientific	5000
弯头镊子	Fine Science Tools	11003-14
一次性聚苯乙烯管，14 mL	Fisher Scientific	14-959-1B
脱氧核糖核酸酶 I	Worthington	LS002139
干冰	Airgas	N/A
Durmont #7 镊子	Fine Science Tools	11271-30
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物	Amresco	0105-500g
乙醇，100%	any	N/A
带滤膜顶端的管，5 mL	VWR	352235
可固定的活力染料 780	Becton Dickinson	565388
葡萄糖	Fisher Chemical	D16-500
Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)	Corning	21-020-CV
血细胞计数板	Andwin Scientific	02-671-51B
止血钳	Fine Science Tools	13004-14
HEPES (N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)	ThermoFisher Scientific	15630080
KCl	Fisher chemical	BP366-500
KH2PO4 (无水)	Sigma Aldrich	P5655-100G
液氮	Airgas	N/A
小鼠 FC 封闭剂 (CD16/32)	Becton Dickinson	553141
Na2HPO4 (无水)	Fisher Chemical	S374-500
NaCl	Fisher chemical	S671-500
针头，25 号	Becton Dickinson	305122
正常小鼠血清	ThermoFisher Scientific	31881
尼龙网筛	VWR	352350
OCT 包埋剂	Sakura	4583
多聚甲醛，20%	Electron Microscopy Sciences	15713-S	用 1 × PBS 稀释至 4%
巴斯德吸管，9 英寸，未堵塞	Fisher Scientific	13-678-20C
PBS (1×)	Corning	21-040-CV
PE 标记的大鼠抗小鼠 CD4 抗体	Becton Dickinson	553730
PE-CF594 标记的大鼠抗小鼠 CD19 抗体	Becton Dickinson	562329
Percoll 密度梯度介质	GE healthcare	17-0891-01
PerCP-Cy5.5 标记的大鼠抗小鼠 CD45 抗体	Becton Dickinson	550994
培养皿，100 mm	VWR	353003
pH 计	Fisher Scientific	13-636-AB150
移液器辅助器	Drummond Scientific Corporation	4-000-101
移液器，200 µl	Gilson	FA10005M
移液器吸头，1 mL	USA Scientific	1111-2831
移液器吸头，200 µl	USA Scientific	1111-1816
移液器，1 mL	Gilson	FA10006M
含 DAPI 的 Prolong Diamond 封片剂	ThermoFisher Scientific	P36962
纯化的大鼠抗小鼠 CD16/CD32 抗体	Becton Dickinson	553141
兔抗小鼠 CD3 抗体 (SP7 克隆)	Abcam	ab16669
兔抗小鼠层粘连蛋白抗体	Abcam	ab11575
大鼠抗小鼠 ERT-R7 抗体	Abcam	ab51824
RPMI 1640 培养基	Corning	10-040-CV
血清学移液管，1 mL	VWR	357521
血清学移液管，10 mL	VWR	357551
血清学移液管，5 mL	VWR	357543
氢氧化钠	Fisher Scientific	S318-100
蔗糖	Fisher chemical	S5-500
手术剪刀	Fine Science Tools	14001-16
手术剪刀，超细	Roboz	RS-5882
注射器，10 mL	Becton Dickinson	302995
注射器，5 mL	Becton Dickinson	309646
台盼蓝	Gibco	15250-061