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制备小鼠脑组织中免疫细胞的单细胞悬液

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2025年7月8日

本文内容

摘要

来源:DiSano, K. D., 等. 分离中枢神经系统组织及其相关脑膜以进行免疫细胞的下游分析J. Vis. Exp. (2020)。

该视频展示了从小鼠脑组织制备免疫细胞单细胞悬液的过程。首先通过酶消化法将细胞从脑组织中释放出来,随后利用密度梯度离心法根据细胞密度分离免疫细胞,从而获得单细胞悬液。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 准备脑和脊髓组织的单细胞悬液

  1. 将含有组织的培养基从离心管中倒入100 mm培养皿顶部,转移脑或脊髓组织。用镊子将组织移至培养皿底部。用无菌剃刀刀片将脑或脊髓组织切碎。用剃刀刀片轻轻刮取,将切碎的组织收集并移至培养皿底部。
    注意: 在以下酶消化方案中,最多可将两条脊髓合并处理。脑组织应单独处理。
  2. 使用5 mL血清移液管,向培养皿中加入3 mL RPMI(Roswell Park Memorial Institute培养基(含10%胎牛血清(FCS))。使用10 mL血清移液管反复吹打,使组织在培养基中重悬,然后转移至15 mL锥形管中。
    注意: 如果下游应用为单细胞或批量RNA测序分析或细胞培养,应测试FCS批次,以确保细胞在分析前未被激活。或者,可使用含0.04% BSA的1×PBS替代含10% FCS的RPMI进行细胞处理。
  3. 使用10 mL刻度移液管,用额外的2 mL培养基冲洗培养皿,以收集任何残留组织,并转移至锥形管中,总体积为5 mL。在处理步骤之间将试管置于冰上保存。
  4. 使用移液器将胶原酶I粉末用Hank's平衡盐溶液(HBSS)培养基重悬,以获得所需浓度(例如,100 mg/mL)。将....

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结果

脊髓/脑膜中CD19+ B细胞和CD4+ T细胞的流式细胞术图谱,TMEV-IDD研究。
图1:中枢神经系统组织中CD45hi浸润性免疫细胞的鉴定。(A)在假手术处理(红色)或TMEV-IDD(蓝色)小鼠脊髓的全部活细胞中,鉴定CD45hi浸润性免疫细胞(P1)、CD45lo小胶质细胞(P2)以及CD45-的少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的设门策略。在假手术处理的小鼠脑和脊髓中仅检测到极少量CD45hi细胞。(B)在TMEV-IDD小鼠的CD45hi浸润性免疫细胞(P1)中鉴定CD19+ B细胞和CD4+ T细胞的设门策略。脑和脊髓组织的设门策略相似。(C)在假手术处理(红色)和慢性TMEV-IDD小鼠(蓝色)脑膜中鉴定CD45hi细胞(P1)的设门策略。(D)在慢性TMEV-IDD小鼠脑膜的CD45.......

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牛血清白蛋白ThermoFisher Scientific37002D
离心机Beckman CoulterAllegra X-12R centrifuge
胶原酶 IWorthingtonLS004196
锥形管,15 mLVWR525-1069
锥形管,50 mLVWR89039-658
盖玻片Hauser Scientific5000
弯头镊子Fine Science Tools11003-14
一次性聚苯乙烯管,14 mLFisher Scientific14-959-1B
脱氧核糖核酸酶 IWorthingtonLS002139
干冰AirgasN/A
Durmont #7 镊子Fine Science Tools11271-30
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物Amresco0105-500g
乙醇,100%anyN/A
带滤膜顶端的管,5 mLVWR352235
可固定的活力染料 780Becton Dickinson565388
葡萄糖Fisher ChemicalD16-500
Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)Corning21-020-CV
血细胞计数板Andwin Scientific02-671-51B
止血钳Fine Science Tools13004-14
HEPES (N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)ThermoFisher Scientific15630080
KClFisher chemicalBP366-500
KH2PO4 (无水)Sigma AldrichP5655-100G
液氮AirgasN/A
小鼠 FC 封闭剂 (CD16/32)Becton Dickinson553141
Na2HPO4 (无水)Fisher ChemicalS374-500
NaClFisher chemicalS671-500
针头,25 号Becton Dickinson305122
正常小鼠血清ThermoFisher Scientific31881
尼龙网筛VWR352350
OCT 包埋剂Sakura4583
多聚甲醛,20%Electron Microscopy Sciences15713-S用 1 × PBS 稀释至 4%
巴斯德吸管,9 英寸,未堵塞Fisher Scientific13-678-20C
PBS (1×)Corning21-040-CV
PE 标记的大鼠抗小鼠 CD4 抗体Becton Dickinson553730
PE-CF594 标记的大鼠抗小鼠 CD19 抗体Becton Dickinson562329
Percoll 密度梯度介质GE healthcare17-0891-01
PerCP-Cy5.5 标记的大鼠抗小鼠 CD45 抗体Becton Dickinson550994
培养皿,100 mmVWR353003
pH 计Fisher Scientific13-636-AB150
移液器辅助器Drummond Scientific Corporation4-000-101
移液器,200 µlGilsonFA10005M
移液器吸头,1 mLUSA Scientific1111-2831
移液器吸头,200 µlUSA Scientific1111-1816
移液器,1 mLGilsonFA10006M
含 DAPI 的 Prolong Diamond 封片剂ThermoFisher ScientificP36962
纯化的大鼠抗小鼠 CD16/CD32 抗体Becton Dickinson553141
兔抗小鼠 CD3 抗体 (SP7 克隆)Abcamab16669
兔抗小鼠层粘连蛋白抗体Abcamab11575
大鼠抗小鼠 ERT-R7 抗体Abcamab51824
RPMI 1640 培养基Corning10-040-CV
血清学移液管,1 mLVWR357521
血清学移液管,10 mLVWR357551
血清学移液管,5 mLVWR357543
氢氧化钠Fisher ScientificS318-100
蔗糖Fisher chemicalS5-500
手术剪刀Fine Science Tools14001-16
手术剪刀,超细RobozRS-5882
注射器,10 mLBecton Dickinson302995
注射器,5 mLBecton Dickinson309646
台盼蓝Gibco15250-061

重印与许可

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DNase I EDTA RPMI

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