来源：Chen, B. 等，通过侧向柔光照射促进脑类器官培养。J. Vis. Exp. (2022)。
本视频展示了利用侧向柔光照明技术增强类胚体的肉眼可视性，从而促进其在脑类器官培养过程中的操作与转移。视频详细说明了柔光照明系统的搭建、培养基更换和类胚体转移的方法，以及诱导类胚体神经分化的步骤，以实现脑类器官的发育。
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方法文章
利用侧向柔光照射优化脑类器官培养的技术
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。
1. 柔性光源灯的准备（第1天）
- 使用厚度为 0.3–0.5 cm、尺寸为 A5 纸大小的透明亚克力板。在亚克力板的正反两面粘贴白色垫片。
- 在板的边缘安装一排 LED 白光灯，使光线从亚克力板的侧面进入，然后平行射出（图 1A–F，图 2B）。
注意： 由于早期 EBs 的直径约为 200 µm 至 300 µm，在超净台的荧光灯下肉眼难以清晰观察。相比之下，由于漫反射增强，使用侧向照射的柔光可清晰检测到 EBs（图 2B，C）。后续实验中建议使用 6 孔板进行 EB 培养。但为了更好地展示柔光的视觉效果，本研究中有时采用培养皿而非培养板来拍摄图片和视频，请勿误解。侧向照射的柔光灯同样适用于 6 孔板。
2. 胚胎团转移与培养基更换（第2-5天）
- 准备一个新的6孔低吸附培养板，每孔加入2 mL拟胚体（embryoid body, EB）形成培养基。
- 使用1000 µL宽口吸头（见材料表）将EBs连同培养基一同吸出，转移至6孔低吸附培养板中（约100个EBs/孔）。
注意： 操作过程中采用步骤1中提到的柔光灯以更便于观察EBs。关闭其他室内光源，以提升柔光的视觉效果。 - 每天更换等体积的新鲜EB形成培养基。利用二次流将EBs聚集至孔中央，然后更换培养基。
- 用移液器缓慢吸取靠近孔边缘的旧培养基，避免用力过猛，否则会将EBs一并吸出。随后加入新鲜培养基重悬EBs。
注意： 二次流原理（图2D）。通过沿圆形轨道旋转培养皿诱导产生涡旋流，由于涡旋流的存在，进而诱导产生指向孔中心的二次流。EBs或类器官在旋转产生的二次流作用下向孔中央聚集，之后可方便地进行换液或EBs转移操作。
- 用移液器缓慢吸取靠近孔边缘的旧培养基，避免用力过猛，否则会将EBs一并吸出。随后加入新鲜培养基重悬EBs。
3. 神经诱导（第5-7天）
- 准备一个新的低黏附6孔板，并向每孔加入3 mL神经诱导培养基（表1）。
- 打开侧向柔光灯（步骤1中提及），并关闭其他室内光源。
- 将拟胚体转移至已加入神经诱导培养基的6孔板中（约100个拟胚体/孔）。转移时尽量减少原始培养基带入新孔中。
注意：介绍拟胚体转移的基本操作技巧。由于重力作用以及拟胚体密度相对培养基较高，重悬后的拟胚体会逐渐沉降，通过如图2E所示的操作即可方便地完成转移。由于游离细胞和死亡细胞碎片的沉降速度较拟胚体更慢，因此可通过此沉降方法去除大部分游离细胞和死亡细胞碎片（图2F）。 - 将样品置于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。
注意：在显微镜下观察，拟胚体直径约为500 µm，边缘呈半透明状，提示已形成神经上皮层。
表1. 神经诱导培养基的成分
| 组分 | 体积 |
| DMEM-F12 | 97 mL |
| N2 supplement | 1 mL |
| Glutamax supplement | 1 mL |
| MEM-NEAA | 1 mL |
| Heparin | 终浓度 1 μg/mL |
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结果
图1：柔光灯的制备。（A）将电源和LED灯安装在亚克力板的一侧（如红虚线框所示）。LED柔光灯的散射波长为450–470 nm，光通量为1300–1800 lm，显色指数为75–85 Ra。（B）检查LED灯珠是否能正常点亮（如红虚线框所示）。（C）在亚克力板的前后两面粘贴白色垫片（如红色箭头所示）。（D）柔光灯的整体外观。（E）也可用市售无框LED绘图灯板替代该柔光灯，后者通常用于临摹草图时的描图。需在LED绘图灯板正上方直接粘贴一层白色薄膜。（F）柔...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 μm 滤膜 | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL 宽口吸头 | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 6 孔低吸附培养板 | NEST Biotechnology, China | 703011 | 用于拟胚体悬浮培养 |
| 离心机 | Eppendorf, Germany | 5810 R | 可用于各种类型的离心管、试剂瓶和工作板的离心。 |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| 肝素 | Merck, Germany | H3149 | |
| Glutamax 添加剂 | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax 添加剂 | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| N2 添加剂 | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| 柔光灯 | NUT | NUT | 一种简易自制装置，制备方法参见补充图 2。 |
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