使用免疫磁珠分离小鼠原代少突胶质细胞

摘要

来源：Flores-Obando, R. E. 等，小鼠原代少突胶质细胞的快速特异性免疫磁分离。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了一种利用磁性分离法从小鼠幼鼠神经细胞悬液中分离原代少突胶质细胞的方法。该技术采用包被有针对少突胶质细胞抗原的特异性抗体的磁珠，从而实现这些细胞的选择性分离。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 小鼠脑皮层解离

1. 使用经70%乙醇清洁的剪刀，通过快速断头法处死出生后5-7天的C57Bl/6N小鼠仔鼠。    
   注意： 每次制备使用5-6只新生小鼠的大脑皮层。平均而言，一只小鼠大脑可获得1-1.5 × 10⁶ 原代少突胶质细胞 (Ols)
2. 用小型解剖剪沿中线剪开头皮，并牵拉暴露颅骨。
3. 从颅骨后部的开口处开始，沿中线小心剪开颅骨，向前额区域延伸，剪切时将剪刀向上提起，以避免损伤脑组织。然后，从颅骨后部的开口沿颅底向每侧眼眶方向剪开。
4. 使用精细镊子将大脑皮层从中脑轻轻剥离，并转移至含有7 mL B27NBMA的60-mm组织培养皿中。对每只脑组织重复步骤2.2至2.4，汇集所有分离的皮层组织。
5. 将皮层组织转移至一个新的60 mm组织培养皿中，该培养皿含有5 mL解离缓冲液（B27NBMA，20–30 U/mL木瓜蛋白酶，2,500 U DNase I）。
6. 将皮层切成约1毫米见方的小块³ 使用#15手术刀片，并在37 °C、5%二氧化碳（CO₂）条件下孵育20分钟₂) 培养箱
7. 加入1 mL 牛生长血清（BGS）以终止酶促反应。
8. 使用10 mL刻度吸管将脑皮层组织连同解离液转移至15 mL锥形离心管中。
9. 使用10 mL血清移液管，轻柔地上下吹打6至8次，以开始解离脑组织，注意尽量减少气泡产生。
10. 让组织块静置 2-3 分钟，然后将上清液转移至新管中。
11. 向组织沉淀中加入含有10% BGS和2500 U DNase I的3 mL B27NBMA。
12. 使用5 mL刻度吸管轻柔吹打组织6-8次，以充分解离脑组织。注意尽量减少气泡产生。
13. 让组织块静置沉降 2-3 分钟。
14. 将上清液转移至新的离心管中。向组织沉淀中加入 3 mL 含 10% BGS/DNase I 的 B27NBMA。
15. 使用 P1000 移液枪头轻轻吹打脑组织，同时将培养基与脑组织的混合物反复吹吸。重复步骤 2.13 和 2.14，直至无明显组织块残留，或 B27NBMA（含 10% BGS/DNase I）耗尽，以先达到者为准。注意尽量减少气泡产生。
16. 将细胞悬液与之前的上清液混合。
17. 将70 µm细胞滤网置于50 mL离心管中。使用10 mL血清移液管，将混合的细胞悬液轻柔地通过70 µm细胞滤网。
18. 用含有10% BGS/DNase I的1 mL B27NBMA洗涤细胞滤网。
19. 弃去细胞滤网。用含10% BGS/DNase I的B27NBMA补至终体积30 mL。
20. 将细胞悬液转移至两个15 mL锥形管中。在200 x g条件下离心10分钟。
21. 移除上清液时避免使细胞暴露于空气中。由于含有细胞碎片，上清液将呈浑浊状。向沉淀中加入3 mL含10% BGS的B27NBMA培养基。
22. 使用 P1000 移液器小心地重悬细胞沉淀。用含 10% BGS 的 B27NBMA 将体积补至 15 mL。
23. 将细胞悬液经一个新的40 µm细胞滤筛过滤。
24. 加入1 mL含10% BGS的B27NBMA洗涤细胞滤网，弃去细胞滤网。
25. 用含10% BGS的B27NBMA定容至30 mL。
26. 将细胞悬液转移至2个15 mL锥形管中。在200 × g条件下离心10分钟。
27. 去除大部分上清液，避免细胞暴露于空气中。用5 mL预冷的磁性细胞分选（MCS）缓冲液重悬细胞沉淀。

2. 细胞计数和活力的测定

1. 在1.5 mL微量离心管中，将100 µL细胞悬液与400 µL台盼蓝溶液混合，制成1:5稀释的0.4%（w/v）溶液。
2. 将盖玻片置于血细胞计数板的计数室中央，使用P10移液器将10 µL细胞稀释液加入两个计数室中，避免溢出。溶液将通过毛细作用进入盖玻片下方。
3. 将血细胞计数板放置于显微镜载物台上，使用40倍物镜调节焦距。
   注意：使用手持计数器分别对五个方格（四个角和一个中心）中的细胞进行计数。只有死细胞会吸收染料而呈蓝色，活细胞和健康细胞则呈圆形且具有折光性，不吸收蓝色染料，从而可计算出每毫升中活细胞和总细胞的数量。

3. O4⁺ 少突胶质细胞的分离

1. 将细胞悬液在 200 × g 条件下离心 10 分钟。
2. 使用真空抽吸小心弃去上清液，避免细胞暴露于空气中。
3. 每 1 × 10⁷ 个总细胞用 90 µL MCS 缓冲液重悬沉淀，随后每 1 × 10⁷ 个细胞加入 10 µL 抗 O4 磁珠。
4. 用手指轻弹 15 mL 锥形管 4–5 次，混匀细胞悬液与磁珠。
5. 在 4 °C 条件下孵育混合物 15 分钟，每隔 5 分钟用手指轻弹 15 mL 锥形管 4–5 次。
6. 每 1 × 10⁷ 个细胞向管中轻柔加入 2 mL MCS 缓冲液洗涤混合物。在 200 × g 条件下离心 10 分钟。
7. 使用真空抽吸小心弃去上清液，避免细胞暴露于空气中。每 1 × 10⁷ 个细胞用 500 µL MCS 缓冲液重悬细胞沉淀。
8. 将磁力分离器固定在磁力架上。将分选柱连接至磁力分离器，并在分选柱上方放置一个 40 µm 细胞筛网。在分选柱下方放置两个 15 mL 或一个 50 mL 锥形管，用于收集穿流液。
9. 用 3 mL MCS 缓冲液预冲洗 40 µm 细胞筛网和分选柱，使缓冲液流过分选柱，注意不可让柱子干燥。
10. 将细胞悬液与磁珠的混合物加入细胞筛网，并进入分选柱中。
11. 用 1 mL MCS 缓冲液冲洗 40 µm 细胞筛网。
12. 弃去细胞筛网，使细胞、磁珠和缓冲液的混合物流过分选柱，注意不可让柱子干燥。
13. 用 3 mL MCS 缓冲液洗涤分选柱 3 次，再用 OL 增殖培养基洗涤 1 次。
14. 将分选柱从磁力分离器上取下，迅速放入一个 15 mL 锥形管中，并立即加入 5 mL OL 增殖培养基。
15. 将推杆置于分选柱顶部，用力下压，将标记的细胞冲洗至 15 mL 锥形管中。
16. 取 100 µL 细胞悬液，按照第 3 节所述方法，使用台盼蓝染色和血细胞计数板测定细胞数量和活力。
    注意：细胞活力高于 80% 可接受用于少突胶质细胞（OL）培养，但大于 90% 为最佳。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 ml 血清移液管	Fisher Scientific	13-676-10J
10 ml 鲁尔锁头注射器	BD, Becton Dickinson	309604
15 ml 圆锥形离心管	Falcon	352097
24 孔组织培养板	Falcon	353935
40 µm 细胞滤器	Fisher Scientific	22368547
50 ml 圆锥形离心管	Falcon	352098
5 ml 血清移液管	Fisher Scientific	13-676-10H
60 mm 组织培养皿	Falcon	353002
70 µm 细胞滤器	Fisher Scientific	22363548
Anti-O4 磁珠 - Anti-O4 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-094-543
Autofil 完整瓶顶过滤装置，0.22 µm 滤膜，250 ml	USA Scientific	6032-1101
Autofil 完整瓶顶过滤装置，0.22 µm 滤膜，250 ml	USA Scientific	6032-1102
B27 补充剂	Invitrogen	17504-044
牛生长血清 (BGS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30541.03
BSA	Fisher Scientific	BP-1600-100
CNTF	Peprotech	450-50
脱氧核糖核酸酶 I (DNAse I)	Worthington	LS002007
EDTA	Fisher Scientific	S311
Feather 一次性手术刀片	Andwin Scientific	EF7281C
葡萄糖	Fisher Scientific	D16-1
GlutaMAX	Invitrogen	35050-61
胰岛素	Invitrogen	12585-014
磁性分离器支架 - MACS 多功能支架	Miltenyi Biotec	130-042-303
磁性分离器 - MiniMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-302
Millex PES 0.22 µm 滤器单元	Millipore	SLG033RS
Neurobasal 培养基 A	Invitrogen	10888-022
木瓜蛋白酶	Worthington	LS003126
不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS	Sigma	D5652
DNase I 储存液			1. 将脱氧核糖核酸酶 I 溶解于冰上预冷的 HBSS 中，浓度为 12,500 U/ml。 2. 在冰上进行过滤除菌。 3. 分装为每管 200 µl，于 -20°C 冷冻过夜。 4. 将分装样品储存于 -20 至 -30°C。
杜氏磷酸盐缓冲液（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）			将一袋粉末溶于 1 升水中，配制成每升含 9.6 克粉末的 1 升培养基。储存于 2–8 °C。
台盼蓝溶液	Corning	25-900-CI
B27NBMA			487.75 mL Neurobasal 培养基 A；10 mL B27 补充剂；1 mL Primocin；1.25 mL GlutaMAX；过滤除菌后储存于 4 °C 直至使用。
B27NBMA + 10% BGS			27 mL B27NBMA；3 mL 牛生长血清
CNTF 储存液（10 µg/ml；1000X）			从 Peprotech（货号 450-50）订购。根据制造商说明（可能因批次而异）用缓冲液（如 DPBS + 0.2% BSA）配制成 0.1 至 1 mg/ml 的溶液。储存于 -80 °C。 工作液（10 µg/ml，1000X） 1. 用 DPBS 配制含 0.2% BSA（Fisher Scientific BP-1600-100）的溶液，并过滤除菌。 2. 将母液分装物用无菌、预冷的 0.2% BSA/DPBS 稀释至 10 µg/ml。 3. 分装（每管 20 µl），并在液氮中快速冷冻。 4. 储存于 -80 °C。
磁性细胞分选 (MCS) 缓冲液			配制含磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.2）、0.5% 牛血清白蛋白（BSA）、0.5 mM EDTA、5 µg/ml 胰岛素、1 g/L 葡萄糖的溶液。通过 0.22 µm Millex 滤器过滤以除菌并脱气。缓冲液储存于 4°C 直至使用。
Hank's 平衡盐溶液 (HBSS) (Sigma			1. 用量筒量取 900 ml 水（温度 15–20 °C），轻轻搅拌。 2. 加入粉末并搅拌至完全溶解。 3. 用少量水冲洗原包装袋，以去除残留粉末。 4. 将冲洗液加入第 2 步的溶液中。 5. 每升终体积加入 0.35 g 碳酸氢钠（7.5% w/v）。 6. 持续搅拌至完全溶解。 7. 边搅拌边调节缓冲液 pH 至比 pH=7.4 低 0.1–0.3 个单位，因为在过滤过程中 pH 可能会上升。建议使用 1N HCl 或 1N NaOH 调节 pH。 8. 加水定容至 1 L。 9. 使用孔径为 0.22 微米的滤膜进行过滤除菌。 10. 储存于 2–8 °C。