制备微图形化基底以研究施万细胞表型

摘要

来源：Xu, Z., Orkwis, 等. 可调细胞外基质微环境的制备用于评估施万细胞表型特化。J. Vis. Exp. (2020)。

该视频介绍了用于研究细胞表型特化的微图形基底的制备方法。使用蛋白质包被的微图形PDMS印章，将微图形转移至PDMS包被的盖玻片上。随后用表面活性剂处理盖玻片，以抑制细胞在非目标区域的黏附。然后加入细胞，使其沉降并附着于图形区域，再进行培养以供后续分析。

方案

1. 可调节细胞培养基底的制备与表征

1. 基底制备​
   1. 使用移液枪枪头剧烈混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）基础弹性体与固化剂，比例介于10:1至60:1之间，直至气泡均匀分散于混合物中。通过真空干燥去除气泡，直至气泡完全消散。
      ​注意: 在PDMS聚合过程中，固化剂与基础弹性体交联，赋予最终聚合物所需的机械性能。通过调整交联比例可改变PDMS的刚度。
   2. 在方形或圆形盖玻片（如 22 mm × 22 mm）上滴加一滴干燥后的 PDMS 混合物（约 0.2 mL），在匀胶机上以 2500 rpm 转速旋转 30 秒。
   3. 将盖玻片置于60 °C烘箱中孵育1-2小时，或在室温下过夜孵育，使PDMS固化。
   4. 使用紫外臭氧清洗仪处理盖玻片7分钟（紫外波长：185 nm和254 nm），以增强表面亲水性。将盖玻片放入无菌的6孔板中。
   5. 在用于细胞培养之前，将基质置于70%乙醇中孵育至少30分钟。
      ​注意： UV-臭氧清洗仪可产生对人类有害的臭氧。操作时应在化学通风橱内或具有良好通风的环境中进行。
2. 微图案化基底制备
   1. 绘制所需的几何形状和细胞黏附区域（900 µm²，1,600 µm² 和 2,500 µm²使用计算机辅助设计（CAD）软件设计图案，并从商业供应商处制作基于这些图案的铬版掩膜。
   2. 在洁净室或无尘环境中，采用标准的光刻技术制备硅晶圆。本应用的关键参数如下：光刻胶：SU-8 2010；旋涂光刻胶的程序：500 rpm 转速下持续10秒，加速度为100 rpm/s，随后3500 rpm 转速下持续30秒，加速度为300 rpm/s；紫外光曝光能量：130 mJ/cm²。
      ​注意硅片上图案的高度在采用这些参数后约为10 µm。在步骤1.2.2之后，使用光学显微镜可观察到矩形或三角形图案外边缘周围潜在的裂纹。将硅片在190 °C下烘烤30分钟有助于消除这些裂纹。
   3. 将图案化的硅晶圆放入一个直径150 mm、高15 mm的圆形培养皿中，并将按步骤1.1.1制备好的脱气PDMS（混合比例10:1）倒入硅晶圆上。
      ​注意确保PDMS厚度至少为5 mm，以便于微接触印刷步骤中的操作。
   4. 在60 °C烘箱中过夜固化硅片上的PDMS。让PDMS冷却至室温。使用外科手术刀从硅片上精确切割出含有正确图案的30 mm × 30 mm方形印章。注意不要损坏硅片。
      ​注意此时，硅晶片可在异丙醇清洗后多次重复使用，以制备更多的印章。
   5. 将PDMS印章和可调式盖玻片（按步骤1.1.1至1.1.3制备）浸入70%乙醇中30分钟以进行灭菌。
   6. 为验证微接触印刷后PDMS印章微图案的有效性，使用过滤的气流干燥PDMS印章表面，并用移液器将50 µg/mL牛血清白蛋白（BSA）（Texas Red标记）溶液滴加至PDMS印章的整个图案化表面，使其完全覆盖。
   7. 将PDMS印章与BSA溶液在室温下孵育1小时，以使蛋白质吸附。
   8. 使用过滤的气流干燥可调盖玻片表面，并按照步骤1.1.5所述提高表面亲水性。
   9. 将PDMS印章风干以去除残留的BSA溶液。
      ​注意注意确保BSA溶液已从印章上完全去除，因为残留的溶液会导致在微接触印刷过程中印章在盖玻片上滑动。
   10. 将印章的图案面与可调盖玻片表面紧密贴合，以实现盖玻片表面的BSA吸附。轻轻将印章压在盖玻片上，持续5分钟。
       注意：不要对印章施加过大的力，否则会导致印章弯曲，引起印章与盖玻片之间的非特异性接触。施加在印章上的力应适中，这是实现成功微接触印刷的关键。
   11. 使用配备FITC（异硫氰酸荧光素）滤光片的荧光显微镜观察微图案。
   12. 若要打印细胞黏附区域而非荧光图案，可用层粘连蛋白（laminin）替代BSA蛋白，并重复步骤1.2.5至1.2.10。
   13. 将盖玻片从基底上取下，转移至已灭菌的6孔板中。每孔加入2 mL 0.2%（w/v）Pluronic F-127溶液，确保溶液覆盖盖玻片表面，室温孵育1小时。
       ​注意Pluronic F-127 可吸附于 PDMS 表面，增加 PDMS 表面的疏水性，从而阻止细胞黏附。
   14. 吸弃Pluronic F-127溶液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤5次，再用细胞培养基洗涤1次，然后接种细胞。SCs的典型接种密度为1,000个细胞/cm²。².
   15. 细胞接种后45分钟，移除细胞培养基，并用PBS洗涤盖玻片2次，以防止多个SCs黏附至同一图案区域。在定量分析前，将细胞置于所需的细胞培养环境中培养48小时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白（BSA），德克萨斯红标记物	Thermo Fisher Scientific	A23017	用于显示微图案的 BSA 染色
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Thermo Fisher Scientific	11965092	细胞培养基
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	16000044	细胞培养基添加剂
纤连蛋白	Thermo Fisher Scientific	33010-018	用于包被盖玻片的蛋白质
荧光显微镜	Nikon	Eclipse Ti2	荧光显微镜
层粘连蛋白	Thermo Fisher Scientific	23017015	用于包被盖玻片的蛋白质
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122	细胞培养基添加剂
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P-2443	阻断非特异性蛋白结合
SYLGARD 184 PDMS 基料与固化剂	Sigma Aldrich	761036	可调节聚合物，用于包被盖玻片
紫外臭氧清洗仪	Novascan		提高 PDMS 的亲水性