从小鼠脊神经根中分离施万细胞

摘要

来源：He, Q., 等，& Ding, F. 体外分离感觉神经与运动神经中的成纤维细胞和施万细胞。J. Vis. Exp. (2020)

本视频概述了从小鼠脊神经根中分离和培养施万细胞的方法。分离后的细胞在特定培养基中进行培养。施万细胞的分离 通过 差异消化与贴壁。随后转移至包被有细胞外基质的盖玻片上，以促进贴附与增殖。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 运动和感觉神经成纤维细胞及施万细胞（Schwann cells）的分离与培养

1. 使用中国南通大学实验动物中心提供的7日龄Sprague-Dawley（SD）大鼠（n=4）。将大鼠置于含有5%异氟烷的麻醉罐中2-3分钟，待其呼吸逐渐减缓并失去自主活动后，用75%乙醇消毒，随后进行断头处死。
2. 使用剪刀剪开背部皮肤约3厘米，去除脊柱。小心打开椎管以暴露脊髓。
3. 将脊髓置于含有2-3 mL冰冻D-Hanks平衡盐溶液（HBSS）的60 mm培养皿中保存。
4. 根据解剖结构，在解剖显微镜下分离并切除腹根（运动神经），然后切除背根（感觉神经）。随后，将其置于冰浴的D-Hanks平衡盐溶液（HBSS）中。
5. 去除HBSS后，用剪刀将神经组织切成3-5 mm的小段，加入1 mL 0.25% (w/v) 胰蛋白酶，在37 °C消化18-20 min。随后加入3-4 mL含10%胎牛血清（FBS）的DMEM终止消化。
6. 轻轻吹打混合液约十次，然后在800 x g 5分钟后，弃去上清液，将沉淀物重悬于2-3 mL含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中。
7. 使用400目滤网过滤细胞悬液，然后将细胞接种于60 mm培养皿中，在37 °C、5% CO2条件下培养。培养4–5天后，待细胞融合度达到90%时，分离第0代（p0）成纤维细胞和雪旺细胞（SCs）。
8. 施万细胞的分离与培养（图1)
   1. 用1×PBS洗涤细胞一次。每60 mm培养皿加入1 mL 0.25% (w/v) 胰蛋白酶（37 °C），在室温下消化细胞8–10秒。随后加入3 mL含10% FBS的DMEM终止消化。
   2. 用移液器轻轻吹打混合液以分离精原细胞（SCs）。随后，收集精原细胞并在800 x g条件下离心 g 5 分钟。
   3. 弃去上清液，将残余物重悬于3 mL含10% FBS、1%青霉素/链霉素、2 µM forskolin和10 ng/mL HRG的DMEM中，然后将细胞接种至未包被的60 mm培养皿中。在37 °C培养30–45 min后，成纤维细胞（少量成纤维细胞与SCs共同消化）贴附于培养皿底部。
   4. 将上清液（包含 SCs）转移至另一个经多聚-L-赖氨酸（PLL）包被的培养皿中，于 37 °C 培养 2 天。

结果

图1： 示意性图示，展示感觉和运动成纤维细胞及施万细胞的分离与纯化步骤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
D-Hank's 平衡盐溶液	Gibco	14170112
DMEM	Corning	10-013-CV
解剖显微镜	Olympus	SZ2-ILST
胎牛血清（FBS）	Gibco	10099-141C
Forskolin	Sigma	F6886-10MG
0.25% (w/v) 胰蛋白酶	Gibco	25200-072
培养皿
离心管
盖玻片
Poly-L-Lysine
CO2 培养箱