在与内皮细胞共培养的同时使用叠氮糖标记神经细胞表面标志物

摘要

来源：Bai, Q., et al. 通过唾液酸聚糖的代谢标记鉴定原代神经干细胞与祖细胞的细胞表面标志物。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种共培养小鼠脑微血管内皮细胞与原代皮层干细胞并利用Ac4ManNAz（叠氮糖修饰的N-叠氮乙酰甘露糖胺四乙酰化物）标记细胞表面糖蛋白的实验方案。该方法可实现对原代细胞表面蛋白的选择性富集与鉴定。

方案

1. 在可渗透支撑小室中制备小鼠内皮细胞培养

注意：BEND3 细胞根据制造商的说明书进行培养。

1. 在500 mL DMEM中加入50 mL FBS和5 mL青霉素-链霉素，配制BEND3细胞培养基（BM），充分混匀。
2. 吸除培养皿中的培养基，用1 mL PBS洗涤BEND3细胞培养物一次。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸）溶液，于37 °C孵育4分钟。
3. 向细胞中加入1 mL BM以中和胰蛋白酶-EDTA，轻轻吹打混匀，使细胞完全解离。将细胞悬液转移至新的15 mL锥形离心管中，在室温（RT）下以400 ×g离心5分钟，形成细胞沉淀。
4. 吸除管中上清液，用9 mL新鲜BM重悬细胞，然后将1 mL细胞悬液加入一个通透性支持插入物中。在基质的下室每孔再加入2 mL新鲜BM。继续培养细胞一天。

2. 神经-内皮共培养体系与Ac4ManNAz标记系统的建立

1. 接种 BEND3 细胞至小室中一天后，先轻轻吸去下室中的培养基，再吸去小室中的培养基。用预热的 DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）清洗小室的内表面 3 次，再用预热的 DMEM 冲洗小室外表面。
2. 向一个小室中加入 1 mL 预热的 AM（贴壁培养基），然后将小室转移至含有原代皮层细胞的孔中。将共培养体系在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 12 小时。
3. 将 Ac4ManNAz 溶于 DMSO（二甲基亚砜）中，配制成 200 mM 的储存液。建立神经-内皮共培养体系 12 小时后，向每个下室加入 1 µL Ac4ManNAz 储存液，向每个小室加入 0.5 µL 储存液。立即轻轻振荡培养板以充分混匀培养基。对于对照组细胞，加入等体积的 DMSO。
4. 继续在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 5 天。使用含 10× bFGF 的 AM 作为换液培养基（RM）。在此期间，每隔一天向每个小室加入 100 µL RM，向每个下室加入 200 µL RM，以补充内皮细胞和神经细胞的营养。换液时，不再向培养体系中添加 Ac4ManNAz 或 DMSO。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-谷氨酰胺	Gibco	25030081	1%
丙酮酸钠	Sigma	P5280	1%
N2 添加剂	Gibco	17502048	1:100
N-乙酰-L-半胱氨酸	Sigma	A7250	1 mM
B27 添加剂	Gibco	17504044	1:50
聚-L-赖氨酸	Sigma	P4707
碱性成纤维细胞生长因子	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
青霉素-链霉素	Gibco	15140122	1%
胎牛血清	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450