从小鼠脑实质微动脉制备脑血管内皮管

摘要

来源：Hakim, M. A.，等，小鼠脑实质微动脉内皮细胞的分离与功能分析，J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了一种从小鼠脑实质中分离血管内皮管的方法。通过酶消化与机械解离相结合，该方法可获得完整保留内皮细胞的血管管状结构。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 溶液与药物

1. 生理盐溶液（PSS）
   1. 使用 140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、10 mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）和 10 mM 葡萄糖配制至少 1 L 的 PSS 溶液。
   2. 配制不含 CaCl₂ 的溶液（无 Ca²⁺ PSS），用于脑小动脉的解剖和内皮管的分离。
      注意：所有溶液均需使用超纯去离子 H2O 配制，并经 0.22 µm 滤膜过滤。确保最终溶液 pH 为 7.4，渗透压在 290 至 300 mOsm 之间。
2. 牛血清白蛋白（BSA，10%）
   1. 将 1 g 冻干 BSA 粉末溶于 10 mL 无 Ca²⁺ PSS 中，盖上烧杯，缓慢搅拌至少 2 小时，使 BSA 完全溶解。
   2. 使用 10 mL 注射器和 0.22 µm 滤膜过滤溶液，并分装....

结果

图1：实质小动脉的解剖与分离。 （A）分离的小鼠脑组织， Willis环结构完整。（B）一块包含大脑中动脉（MCA，白色箭头所示）的矩形脑组织样本。（C）从组织上部剥离软脑膜（小动脉，蓝色箭头所示）。（D）连接于大脑中动脉（黄色箭头所示）的小动脉（蓝色箭头头标记轮廓）。（E）脑组织中已识别的小动脉（蓝色箭头所示）。（F）从小块松散组织中拉出小动脉（蓝色箭头所示）。请注意，E和F图展示了一种小动脉分离的替代方法（参见实验方案步骤3.2.3）。比例尺 = 2 mm（A,B,C）、0.2 mm（D）和1 mm（E,F）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
浴槽冷却器（Isotemp 500LCU）	赛默飞世尔科技	13874647
硼硅酸盐玻璃毛细管（Pinning）	Warner Instruments	G150T-6
硼硅酸盐玻璃毛细管（尖锐电极）	华纳仪器	GC100F-10
硼硅酸盐玻璃毛细管（研磨）	美国佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司（World Precision Instruments, WPI）	1B100-4
BSA：牛血清白蛋白	Sigma	A7906
CaCl2氯化钙	Sigma	223506
胶原酶（H型混合物）	Sigma	C8051
数据采集数字化仪	Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔	Digidata 1550A
解剖皿（带炭黑色Sylgard底的玻璃培养皿）	美国佛蒙特州圣奥尔本斯市，Living Systems Instrumentation公司	DD-90-S-BLK
二硫苏糖醇	Sigma	D8255
DMSO：二甲基亚砜	Sigma	D8418
弹性蛋白酶（猪胰腺）	Sigma	E7885
流量控制阀	Warner Instruments	FR-50
荧光系统接口，ARC 灯 & 电源、超速开关和光电倍增管	Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔	IonOptix 系统
镊子（尖头、锋利）	FST	Dumont #5 & 杜蒙特 #55
葡萄糖	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	G7021
HEPES：（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）	Sigma	H4034
KCl：氯化钾	Sigma	P9541
MgCl₂2氯化镁	Sigma	M2670
显微操作仪	锡斯基尤	MX10
数字微移液器拉制仪	Sutter Instruments，诺瓦托，加利福尼亚州，美国	P-97 或 P-1000
显微镜（Nikon-倒置）	尼康仪器公司，美国纽约州梅尔维尔	Ts2
显微镜（Nikon 倒置）	尼康仪器公司	Eclipse TS100
显微镜载物台（铝制）	美国俄勒冈州格兰茨帕斯，西斯基尤	8090P
显微注射泵控制器	美国佛罗里达州萨拉索塔世界精密仪器公司（WPI）	SYS-MICRO4
NaCl：氯化钠	Sigma	S7653
木瓜蛋白酶	Sigma	P4762
相差物镜	尼康仪器公司	(Ph1 DL；10X & 20倍)
剪刀（3 mm & 7 毫米刀片	Fine Science Tools（或 FST），美国加利福尼亚州福斯特市	Moria MC52 & 15000-00
剪刀（Vannas 型；9.5 mm） & 3 毫米刀片	World Precision Instruments	555640S, 14364
双通道温度控制器	Warner Instruments	TC-344B 或 C
阀门控制系统	Warner Instruments	VC-6