从小鼠脑实质微动脉制备脑血管内皮管

摘要

来源：Hakim, M. A.，等，小鼠脑实质微动脉内皮细胞的分离与功能分析，J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了一种从小鼠脑实质中分离血管内皮管的方法。通过酶消化与机械解离相结合，该方法可获得完整保留内皮细胞的血管管状结构。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 溶液与药物

1. 生理盐溶液（PSS）
   1. 使用 140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、10 mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）和 10 mM 葡萄糖配制至少 1 L 的 PSS 溶液。
   2. 配制不含 CaCl₂ 的溶液（无 Ca²⁺ PSS），用于脑小动脉的解剖和内皮管的分离。
      注意：所有溶液均需使用超纯去离子 H2O 配制，并经 0.22 µm 滤膜过滤。确保最终溶液 pH 为 7.4，渗透压在 290 至 300 mOsm 之间。
2. 牛血清白蛋白（BSA，10%）
   1. 将 1 g 冻干 BSA 粉末溶于 10 mL 无 Ca²⁺ PSS 中，盖上烧杯，缓慢搅拌至少 2 小时，使 BSA 完全溶解。
   2. 使用 10 mL 注射器和 0.22 µm 滤膜过滤溶液，并分装成 1 mL 等份，于 -20 °C 保存。
3. 解剖溶液
   1. 将 500 µL BSA（10%）加入 49.5 mL 无 Ca²⁺ PSS 中，总体积为 50 mL。
   2. 将溶液转移至培养皿中，用于小动脉解剖。
4. 分离溶液
   1. 向 49.5 mL 无 Ca²⁺ PSS 中加入 5 µL CaCl₂ 溶液（1 M）和 500 µL BSA（10%），总体积为 50 mL。室温孵育至少 1 小时。
5. 酶溶液
   1. 配制 1 mL 消化液，含 100 µg/mL 木瓜蛋白酶、170 µg/mL 二硫赤藓醇、250 µg/mL 胶原酶（H 型混合物）和 40 µg/mL 弹性蛋白酶。
      注意：酶活性可能存在差异，但成功实验通常需要以下酶活性：木瓜蛋白酶 ≥ 10 单位/mg，胶原酶 ≥ 1 单位/mg，弹性蛋白酶 ≥ 5 单位/mg。
      

2. 实质小动脉的分离

注意：本方案选择源自大脑中动脉（MCAs）并嵌入脑实质中的小动脉进行实验。小动脉的分离方法参照先前描述的方法11，并进行了修改。

1. 使用钢针（直径：0.2 mm，长度：11 至 12 mm）将分离的脑组织固定在含有炭粉掺杂硅聚合物涂层的培养皿中的冷解剖液内（涂层深度 ≥ 50 cm）。
2. 使用锋利且对齐的解剖剪，在大脑中动脉（MCA）周围剪取一块脑组织矩形区域（长度：5 mm，宽度：3 mm）（图1B），确保该组织片段的上部超过 Willis 环的分支点。如有必要，从脑的另一侧半球剪取另一块脑组织矩形区域，以获取更多微动脉。
3. 使用钢针（直径：0.1 mm，长度：13 至 14 mm）将分离的脑组织片段固定在培养皿中，使 MCA 朝上（远离 Willis 环）。用小镊子在钢针附近小心地做一浅切口，去除软脑膜，从一端轻轻剥离至另一端（图1C）。如需获取更多微动脉，可对另一组织片段进行软脑膜去除。小心地用钢针将带有从 MCA 分支出的脑实质微动脉的分离软脑膜固定于培养皿中，并解剖脑实质微动脉（图1D），确保微动脉不受损伤。
   注意：若微动脉无法随软脑膜轻易从脑实质中拉出，可使用精细镊子从 Willis 环处 MCA 的分支点开始，深入脑组织进行分离。找到微动脉后，小心松解其周围的组织（图1E），并握住微动脉的上端，轻柔地将其从脑实质中拉出（图1F）。每块脑组织矩形区域可分离出多条微动脉（长度：约 1.5–2 mm）。
4. 确保微动脉清洁，无任何组织附着，并切除任何残留的远端分支（图2A）。将此清洁且完整的微动脉用于酶消化。或者，如需制备内皮管，可将每条微动脉切成两段（长度：0.75–1 mm），分别进行酶消化。
   

3. 实质小动脉的消化及血管内皮管的制备

1. 仪器与移液器的摆放
   注意： 从脑组织中分离动脉内皮管的方法已有文献报道13,18。本方案在此基础上进行了改进，适用于从脑实质（颅内）微动脉中分离内皮细胞。可将多根微动脉或微动脉片段合并后进行酶消化处理。
   1. 组装用于制备内皮管的吹打装置13，该装置包括一个由铝制平台支撑的腔室及显微操作器。配备一台带有物镜（5x–60x）的显微镜，并连接相机至计算机显示器。将连接泵控制器的显微注射器固定在平台及样本旁。
   2. 将一支预先填充矿物油的研磨移液管固定在显微注射器活塞上方。使用带泵控制器的显微注射器，从矿物油上方吸取解离溶液至研磨移液管中（约130 nL），注意避免移液管中产生气泡。
2. 小动脉节段的部分消化
   1. 将完整的微动脉节段放入含有100 µg/mL木瓜蛋白酶、170 µg/mL二硫赤藓醇、250 µg/mL胶原酶和40 µg/mL弹性蛋白酶的1 mL消化液中，置于10 mL玻璃试管内。在34 °C下孵育微动脉节段10–12分钟。
   2. 消化后，将酶溶液替换为3-4 mL室温的新鲜解离溶液。
3. 小动脉内皮管的分离
   ​注意： 消化完成后更换酶溶液，将一个或多个部分消化的组织段转移至连接在移动平台上的灌流 chamber 内的解离溶液中。在显微镜下以100倍至200倍放大倍数观察，选择一个部分消化但未破裂的血管段，并将其聚焦于视野中。
   1. 将连接至微量注射器的吹打移液管放入腔室中的解离溶液内，并置于消化后的血管段一端附近。在泵控制器上设置1-3 nL/s范围内的流速，进行轻柔吹打。
   2. 在保持100倍至200倍放大倍数的同时，将小动脉节段吸入移液管，然后推出以分离外膜和平滑肌细胞（图 1B）。轻柔吹打血管节段，直至所有平滑肌细胞均被分离，仅剩内皮细胞保持完整的“管状”结构。
      注意： 如有必要，在吹打过程中可使用尖头镊子小心去除内皮管上的离解外膜及内弹性膜。通常仅需数次吹打即可获得完整的内皮管。
   3. 使用显微操作仪将腔室中玻璃盖玻片上的内皮管两端用硼硅酸盐玻璃固定移液管固定图2C,D).
4. 固定小动脉内皮管
   1. 用灌流溶液（PSS 含 2 mM CaCl₂）替换解离溶液₂同时确保非内皮物质从腔室中被冲洗干净。
   2. 将固定好的内皮管转移至用于持续灌流和细胞内或荧光记录/成像的显微镜装置中的移动平台。
   3. 实验过程中持续灌注PSS。使用管路内流量控制阀手动调节流速（5–7 mL/min），使其与层流条件保持一致，并根据真空吸力程度匹配溶液的进样流量。在采集背景数据和/或染料加载前，至少让PSS灌注腔室5分钟，以充分灌流内皮管。

结果

图1：实质小动脉的解剖与分离。 （A）分离的小鼠脑组织， Willis环结构完整。（B）一块包含大脑中动脉（MCA，白色箭头所示）的矩形脑组织样本。（C）从组织上部剥离软脑膜（小动脉，蓝色箭头所示）。（D）连接于大脑中动脉（黄色箭头所示）的小动脉（蓝色箭头头标记轮廓）。（E）脑组织中已识别的小动脉（蓝色箭头所示）。（F）从小块松散组织中拉出小动脉（蓝色箭头所示）。请注意，E和F图展示了一种小动脉分离的替代方法（参见实验方案步骤3.2.3）。比例尺 = 2 mm（A,B,C）、0.2 mm（D）和1 mm（E,F）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
浴槽冷却器（Isotemp 500LCU）	赛默飞世尔科技	13874647
硼硅酸盐玻璃毛细管（Pinning）	Warner Instruments	G150T-6
硼硅酸盐玻璃毛细管（尖锐电极）	华纳仪器	GC100F-10
硼硅酸盐玻璃毛细管（研磨）	美国佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司（World Precision Instruments, WPI）	1B100-4
BSA：牛血清白蛋白	Sigma	A7906
CaCl2氯化钙	Sigma	223506
胶原酶（H型混合物）	Sigma	C8051
数据采集数字化仪	Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔	Digidata 1550A
解剖皿（带炭黑色Sylgard底的玻璃培养皿）	美国佛蒙特州圣奥尔本斯市，Living Systems Instrumentation公司	DD-90-S-BLK
二硫苏糖醇	Sigma	D8255
DMSO：二甲基亚砜	Sigma	D8418
弹性蛋白酶（猪胰腺）	Sigma	E7885
流量控制阀	Warner Instruments	FR-50
荧光系统接口，ARC 灯 & 电源、超速开关和光电倍增管	Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔	IonOptix 系统
镊子（尖头、锋利）	FST	Dumont #5 & 杜蒙特 #55
葡萄糖	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	G7021
HEPES：（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）	Sigma	H4034
KCl：氯化钾	Sigma	P9541
MgCl₂2氯化镁	Sigma	M2670
显微操作仪	锡斯基尤	MX10
数字微移液器拉制仪	Sutter Instruments，诺瓦托，加利福尼亚州，美国	P-97 或 P-1000
显微镜（Nikon-倒置）	尼康仪器公司，美国纽约州梅尔维尔	Ts2
显微镜（Nikon 倒置）	尼康仪器公司	Eclipse TS100
显微镜载物台（铝制）	美国俄勒冈州格兰茨帕斯，西斯基尤	8090P
显微注射泵控制器	美国佛罗里达州萨拉索塔世界精密仪器公司（WPI）	SYS-MICRO4
NaCl：氯化钠	Sigma	S7653
木瓜蛋白酶	Sigma	P4762
相差物镜	尼康仪器公司	(Ph1 DL；10X & 20倍)
剪刀（3 mm & 7 毫米刀片	Fine Science Tools（或 FST），美国加利福尼亚州福斯特市	Moria MC52 & 15000-00
剪刀（Vannas 型；9.5 mm） & 3 毫米刀片	World Precision Instruments	555640S, 14364
双通道温度控制器	Warner Instruments	TC-344B 或 C
阀门控制系统	Warner Instruments	VC-6