构建促炎性器官培养模型以模拟早期椎间盘退变疾病

摘要

来源：Saravi, B.，等。一种模拟早期椎间盘退变性疾病的促炎性退变器官培养模型。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了一种在生物反应器中培养牛椎间盘的技术，以建立三维器官培养模型。通过向椎间盘施加特定的营养缺乏培养基和退变性压力条件，模拟椎间盘疾病早期阶段所观察到的促炎性和退变性微环境。治疗后测量椎间盘高度，以分析营养缺乏和退变性负荷的影响。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 牛椎间盘的解剖

1. 用自来水彻底冲洗整个尾部，以去除表面的污垢和毛发。
   注意： 若尾部完整且远端保留，每条尾部最多可使用9个椎间盘（IVD）（尾椎1-9），具体数量取决于所需IVD的尺寸。考虑到所需直径在15-20 mm之间，本实验中每条尾部使用5个IVD，共使用12条牛尾。
2. 将整个尾部浸入盛有1%聚维酮碘溶液的容器中，浸泡10分钟。用无菌纱布短暂擦干尾部，并将其放置在无菌铺巾上。
   注意： 在解剖椎间盘过程中，应使用浸有林格氏液的纱布润湿尾部，以防脱水。将尾部（或剩余节段）包裹在湿润纱布中保存，直至整个解剖过程完成。
3. 使用手术刀（No. 20）尽可能彻底地去除尾椎上的软组织，以便识别椎间盘。使用骨剪去除椎骨的棘突和横突。
   注意： 选择符合所需直径的椎间盘。本研究中使用的椎间盘直径范围为15-20 mm。
4. 使用骨剪在每个椎体中部横向切断，以获得独立的运动节段。将运动节段放入含有浸润林格氏液纱布的培养皿中。
5. 通过触诊并轻轻移动运动节段来定位椎间盘和椎体。使用带锯在椎间盘的生长板处进行两次平行切割，分别位于椎间盘两侧。通过触摸并找到紧邻椎间盘（柔软）的骨性终板部分（坚硬）的凸起部位，确定生长板的位置，切割时应距离椎间盘向椎体方向保留约0.5-1 mm的安全距离。切割椎体时，确保带锯刀片用林格氏液冷却。
6. 将椎间盘转移至洁净的培养皿中，内含浸润林格氏液的洁净纱布。
   注意： 纱布应保持湿润但不过于潮湿，以防椎间盘吸水膨胀。
7. 使用手术刀片刮除椎体（红色/粉红色骨组织）和生长板（白色软骨），保留终板完整（黄粉色）。为后续加载实验，使两个表面平整且相互平行。将刮除后的椎间盘转移至新的培养皿中，内含浸润林格氏液的纱布。
   注意： 操作时应佩戴金属防护手套，以保护手持椎间盘和刮除过程中的手部安全。
8. 使用游标卡尺测量椎间盘的高度和直径。使用喷射灌洗系统，以林格氏液清洗椎骨内的血凝块。
9. 将椎间盘转移至50 mL塑料管中，每管放置一个椎间盘。每个椎间盘加入25 mL磷酸盐缓冲液（PBS）+ 10%青霉素/链霉素（P/S），在室温下置于摇床上震荡15分钟。
10. 吸除上清液，每个椎间盘加入10 mL PBS + 1% P/S，震荡清洗2分钟。

2. 椎间盘体外培养与加载

1. 将椎间盘转移至IVD培养室，加入IVD培养基（DMEM高糖培养基（4.5 g/L葡萄糖，用于生理组）或低糖DMEM（2 g/L葡萄糖，用于病理组）+ 1% 青霉素/链霉素（P/S）+ 2% 胎牛血清 + 1% ITS（含5 µg/mL胰岛素、6 µg/mL转铁蛋白和5 ng/mL亚硒酸）+ 50 µg/mL抗坏血酸-2-磷酸 + 1% 非必需氨基酸 + 50 µg/mL抗菌剂（用于原代细胞）），置于37 °C、85%湿度、5% CO₂的培养箱中培养。
2. 根据实验分组，在生物反应器系统中培养椎间盘4天。病理组采用退变性加载条件：0.32–0.5 MPa，5 Hz，每日2小时；生理对照组采用生理性加载方案：0.02–0.2 MPa，0.2 Hz，每日2小时。
   注意：在加载过程中，将IVD置于含有5 mL IVD培养基的培养室中。培养基体积取决于生物反应器加载室的大小。加载结束后，将IVD转移至六孔板中，每孔加入7 mL IVD培养基，进行自由膨胀恢复。
3. 为分析实验期间椎间盘高度的变化，需在IVD解剖后（基线）使用游标卡尺测量椎间盘高度，并在实验期间每日于自由膨胀期结束后及动态加载后持续测量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗坏血酸-2-磷酸	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	A8960
带锯	Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany	model 30/833
聚维酮碘	Munndipharma, Frankfurt, Germany
Corning ITS 预混液	Corning Inc., New York, USA	354350
DMEM 高糖	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	10741574
DMEM 低糖	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11564446
分子生物学级乙醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	09-0851
胎牛血清 (FBS)	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	A4766801
非必需氨基酸溶液	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11140050
青霉素/链霉素 (P/S)	gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11548876
磷酸盐缓冲液片剂	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P4417
Primocin	InvivoGen, Sandiego, USA	ant-pm-05
Pulsavac Jet Lavage System	Zimmer, IN,USA