使用工程慢病毒在神经元中分化人类多能干细胞

Abstract

来源:Assetta， B.， et al.， 从多能干细胞生成人类神经元和少突胶质细胞，用于模拟神经元-少突胶质细胞相互作用。J. Vis. Exp. （2020 年）。

该视频演示了通过在四环素反应元件的控制下用携带神经源性转录因子基因的工程慢病毒转染人类多能干细胞，然后用四环素衍生物和成熟培养基处理，诱导人类多能干细胞分化为神经元的过程。

Protocol

1. 人类多能干细胞的人类神经元诱导

1. 慢病毒制备（~5 天，如前所述的详细方案）
   1. 进行转染时，在每个 T75 培养瓶中铺板 ~100 万个 HEK293T 细胞，使其汇合 ~40%。用表达四环素诱导型 Ngn2 和嘌呤霉素抗性基因（PuroR;在相同的 TetO 启动子控制下）、rtTA 和三种辅助质粒 pRSV-REV、pMDLg/pRRE 和 VSV-G（12 μg 慢病毒载体 DNA 和每种辅助质粒 DNA 6 μg）的质粒转染它们。每种慢病毒制剂至少准备三个培养瓶。按照制造商的说明使用 PEI 进行转染。16 小时后更换培养基并丢弃。
   2. 通过每天收集培养基收获释放的病毒颗粒，并更换为新鲜培养基 3 天。汇集收集的含有病毒颗粒的培养基进行纯化。通过 0.22 μm 过滤器过滤病毒，并以 49,000 x g 离心 90 分钟。将沉淀重悬于适当体积的 PBS-葡萄糖 （~150 μL） 中。
2. 神经元诱导（~5 天）
   注意: 这种诱导方案（图 1A;流程图）对经过验证的多能性的 iPS 和 ES 细胞都非常有效（可以通过对表征良好的多能性标志物进行免疫组织化学染色来测定;图 1B）。
   1. 使用市售的 H1 人 ES 细胞，传代 52 代（参见材料表）。使用 ES 细胞维持培养基（参见材料表）在细胞外基质溶液包被的 6 孔板（每个 6 孔板 ~0.5 mg 基质溶液;参见材料表）上培养细胞，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育板。
   2. 在第 -2 天，用 1 mL 细胞分离溶液分离 ES 细胞（80% 汇合）（参见材料表）并在室温下孵育 10 分钟。将细胞转移到试管中;用 2 mL 培养基洗涤孔，并在同一管中混合。以 300 x g 离心 5 分钟，将沉淀重悬于培养基中，然后将细胞以每孔 1 x 10₅ 个细胞的接种密度接种到基质包被的 6 孔板上。
   3. 在第 -1 天，将表达 Ngn2 的慢病毒加上 PuroR 和 rtTA 以及聚凝胺 （8 μg/ml） 添加到新鲜 ES 细胞维持培养基中的 ES 细胞中（参见材料表）。病毒的确切数量应由实际滴度或滴定来确定。我们通常在 6 孔板中每孔添加 5 μL 每种病毒。
   4. 第 0 天，在含 N2 补充剂的 DMEM-F12 培养基中加入多西环素（2 μg/mL 以激活 Ngn2 表达），不含形态发生剂。
   5. 第 1 天，在 DMEM-F12 加 N2 和多西环素的新鲜培养基中加入嘌呤霉素，至终浓度为 1 μg/mL 培养基。在嘌呤霉素中选择转导的细胞至少 24 小时。如果病毒滴度低，可能需要更高的嘌呤霉素浓度（高达 5 μg/mL）和更长的选择期（长达 48 小时）来充分去除转导不足的细胞。
   6. 第 2 天，用细胞分离溶液分离分化的神经元（参见材料表），将它们重新接种在涂有基质溶液的 24 孔板（80,000–200,000 个细胞/孔）上（参见材料表），并将它们维持在不含多西环素的 NBA/B27 培养基中。晶种密度至关重要。
   7. 在这个阶段，分离的神经元可以在专门的商业冷冻培养基中冷冻（参见材料表），并在液氮中储存长达 3 个月。纯神经元可以被铺板，导致解冻后典型的 ~15%–20% 细胞死亡，单独培养或与其他脑细胞类型共培养。
   8. 按照制造商的说明，在涂有基于细胞外基质的溶液的板上培养纯 iN（参见材料表）。特征性锥体形态应在第 4 天（和第 6 天;图 1C）。突触形成最早可在第 14 至 16 天检测到，并在第 24 天通过标准突触前和突触后标志物的免疫组织化学染色而突出。（图 1D;用突触前标志物突触蛋白 1 和树突状标志物 Map2 标记）。

Results

图 1:从 hPSC 直接生成人诱导神经元 （iN）。 （A） iN 生成流程图。（B） 人多能干细胞 （H1） 起始培养的代表性明场和免疫荧光图像，以确认多能性。Oct4 显示为红色，Sox2 显示为绿色。（C） 第 4 天和第 6 天 iN 的代表性明场图像。（D） 在纯培养物中生长 24 天并通过树突标志物 Map2 和突触前标志物突触蛋白 1 （Syn1） 免疫荧光染色的 iN 中树突状树枝状化和突触点的特征形态。

Materials