利用基因工程慢病毒实现人多能干细胞向神经元的分化

摘要

来源：Assetta, B.，等，利用多能干细胞生成人类神经元和少突胶质细胞以模拟神经元-少突胶质细胞相互作用。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了通过转染携带受四环素反应元件调控的神经发生转录因子基因的工程化慢病毒，诱导人多能干细胞分化为神经元，并随后用四环素衍生物和成熟培养基处理的过程。

方案

1. 由人多能干细胞诱导人神经元

1. 慢病毒制备（约5天，详细方案如前所述）
   1. 将约100万个HEK293T细胞接种于每个T75培养瓶中，使其在转染时融合度约为40%。使用表达四环素诱导型Ngn2和嘌呤霉素抗性基因（PuroR；在同一TetO启动子控制下）、rtTA以及三种辅助质粒pRSV-REV、pMDLg/pRRE和VSV-G的质粒进行转染（慢病毒载体DNA为12 µg，每种辅助质粒DNA为6 µg）。每次慢病毒制备至少准备三个培养瓶。按照生产商说明书使用PEI进行转染。16小时后更换培养基并弃去旧培养基。
   2. 通过每天收集培养上清以收获释放的病毒颗粒，并补充新鲜培养基，持续3天。合并含有病毒颗粒的收集液用于纯化。用0.22 µm滤器过滤病毒液，然后在49,000 × g 条件下离心90分钟。将沉淀重悬于适当体积的PBS-葡萄糖溶液中（约150 µL）。
2. 神经元诱导（约5天）
   注意：该诱导方案（图1A；流程图）对经验证具有多能性的iPS细胞和ES细胞均非常有效（可通过免疫组织化学染色检测明确的多能性标志物来验证；图1B）。
   1. 使用商业化获得的H1人源ES细胞（传代52代，见材料表）。将细胞培养于包被了细胞外基质溶液的6孔板上（每块6孔板约使用0.5 mg基质溶液；见材料表），使用ES细胞维持培养基（见材料表），在37 °C、5% CO₂条件下培养。
   2. 第-2天，用1 mL细胞解离溶液（见材料表）解离ES细胞（融合度约80%），室温孵育10分钟。将细胞转移至离心管中，用2 mL培养基洗涤孔板并合并至同一离心管。在300 × g 条件下离心5分钟，将沉淀重悬于培养基中，并以每孔1 × 10₅个细胞的接种密度接种到包被基质的6孔板中。
   3. 第-1天，在新鲜ES细胞维持培养基中加入表达Ngn2和PuroR的慢病毒以及rtTA，同时加入polybrene（8 µg/mL）（见材料表）。病毒的具体用量应根据实际滴度或滴定结果确定。通常每孔（6孔板）加入5 µL病毒液。
   4. 第0天，在不含形态发生素的DMEM-F12培养基中加入N2补充剂和多西环素（2 µg/mL），以激活Ngn2表达。
   5. 第1天，在含N2补充剂和多西环素的新鲜DMEM-F12培养基中加入嘌呤霉素，终浓度为1 µg/mL。用嘌呤霉素筛选转导细胞至少24小时。若病毒滴度较低，可能需要更高的嘌呤霉素浓度（最高达5 µg/mL）和更长的筛选时间（最长48小时），以充分清除转导不足的细胞。
   6. 第2天，用细胞解离溶液（见材料表）解离正在分化的神经元，将其重新接种至包被基质溶液的24孔板中（每孔80,000–200,000个细胞；见材料表），并在不含多西环素的NBA/B27培养基中继续培养。接种密度至关重要。
   7. 在此阶段，解离的神经元可使用专用的商业化冻存液（见材料表）冷冻，并在液氮中保存长达3个月。解冻后，根据典型的约15%–20%细胞死亡率计算接种量，纯化的神经元可单独培养或与其他脑细胞类型共培养。
   8. 将纯化的iNs培养于按照生产商说明包被了基于细胞外基质溶液的培养板上（见材料表）。典型的锥体样形态在第4天（及第6天；图1C）应已明显可见。通过标准的突触前和突触后标志物免疫组织化学染色，最早可在第14至16天检测到突触形成，第24天时突触形成显著增强（图1D；使用突触前标志物Synapsin 1和树突标志物Map2标记）。

结果

图1：由人多能干细胞（hPSCs）直接生成人诱导性神经元（iNs）。（A）iN生成的流程图。（B）起始培养的人多能干细胞系（H1）的代表性明场与免疫荧光图像，用于验证其多能性。Oct4以红色显示，Sox2以绿色显示。（C）第4天和第6天iNs的代表性明场图像。（D）在纯培养条件下培养24天后iNs的典型形态，包括树突分支和突触样点状结构，经免疫荧光染色显示树突标志物Map2和突触前标志物Synapsin 1（Syn1）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
B27 添加剂	ThermoFisher	17504044
DMEM/F12 培养基	STEMCELL Technologies	36254
DMSO	ThermoFisher	D12345
强力霉素	MilliporeSigma	D3072
H1 人胚胎干细胞	WiCell	WA01
Matrigel	Corning	354234
mTeSR plus	STEMCELL Technologies	5825
N2 添加剂	ThermoFisher	17502001
Neurobasal A 培养基	ThermoFisher	10888-022
非必需氨基酸	ThermoFisher	11140-050
PEI	VWR	71002-812
pMDLg/pRRE	Addgene	12251
Polybrene	MilliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	Addgene	12253
嘌呤霉素	ThermoFisher	A1113803
STEMdiff 神经前体细胞冻存培养基	STEMCELL Technologies	5838
STEMdiff SMADi 神经诱导试剂盒	STEMCELL Technologies	8581
Tempo-iOlogo：人iPSC来源的少突胶质前体细胞	Tempo BioScience	SKU102
TetO-Ng2-Puro	Addgene	52047
VSV-G	Addgene	12259