将小鼠胚胎干细胞分化为联网神经元群

摘要

来源:Hubbard， K. et al.， 干细胞衍生的中枢神经系统神经元网络培养物中生物神经毒素的功能评估。J. Vis. Exp. （2015 年）。

该视频演示了一种将胚胎干细胞分化为具有功能突触的网络神经元群的技术。它概述了胚胎干细胞分化为神经元、诱导神经元网络形成以及用网络神经元富集培养物所涉及的步骤。

方案

1. 神经元分化

注意:在中午之前执行步骤 1.1 - 1.5，在中午之后执行步骤 1.7。图 1A 显示了区分程序的概述。

1. 将 350 μl （3.5 x 10，⁶） 的 ESC 转移到含有 25 ml 分化培养基的 10 cm 低附着培养皿中。置于设置为 30 - 45 rpm 的轨道振荡器上，置于 37 °C 和 5% CO₂ 的组织培养箱内。这是分化的第一天，称为体外日（DIV）-8.
   注意:使用超低附着培养皿会增加该方法的成本，但产生的产量比细菌培养皿略高，因为聚集体偶尔会粘附在培养皿上。如果首选不同的培养皿大小，则可以相应地缩放中等体积和细胞数。
2. 48 小时 （DIV -6） 后，使用 25 ml 移液管将分化细胞聚集体转移到 50 ml 锥形管中。立即向培养皿中加入新鲜的 25 ml 分化培养基。
3. 让聚集体在 2 - 5 分钟内沉降，产生 1 - 2 mm 深的可见颗粒。忽略悬浮液中残留的单个细胞或小聚集体。小心吸出培养基，并使用 P1000 将细胞沉淀转移回培养皿中。放在组织培养箱中的旋转振荡器上。
4. 在 DIV -4 处，重复步骤 1.2。颗粒深 2 - 4 mm。将补充有 6 μM 全反式维甲酸 （RA） 的 30 ml 分化培养基更换到培养皿中。返回组织培养箱中的旋转摇床再放置 48 小时。
5. 在 DIV -2 处，重复步骤 1.3。此时颗粒将深 4 - 8 毫米。
6. 在 DIV -1 处，按照第 2 节准备电镀表面。
7. 在 DIV 0 时，在 37 °C 下解冻 5 ml 预先分装和冷冻的 NPC 胰蛋白酶消化培养基 5 - 10 分钟，然后置于组织培养罩中。使用 25 ml 移液管，将区分聚集体转移到 50 ml 锥形管中。让聚集体沉淀并小心吸出培养基。用 10 ml PBS 洗涤沉淀两次，使聚集体在两次洗涤之间沉淀。
8. 第二次 PBS 洗涤后，向沉淀中加入 5 ml NPC 胰蛋白酶消化培养基，并在 37 °C 下孵育 5 分钟。2.5 分钟后轻轻弹动试管。
9. 加入 5 ml 0.1% 大豆胰蛋白酶抑制剂 （STI） 灭活胰蛋白酶，倒置混合。用 10 ml 血清移液管轻轻研磨 10 - 15 次，直到产生相对均匀的细胞悬液。
10. 将细胞悬液缓慢转移到放置在 50 ml 锥形管顶部的 40 μm 或 70 μm 细胞过滤器中。过滤完所有悬浮液后，加入 1 ml N 2 培养基，通过过滤器洗涤剩余的细胞，并以 200 x g 的速度沉淀解离的细胞悬液 6 分钟。
11. 吸出培养基而不干扰沉淀。用 10 ml N2 培养基洗涤细胞两次，以 200 x g 的速率沉淀细胞 5 分钟，并在两次洗涤之间用 P1000 研磨。在第二次洗涤之前，使用血细胞计数器对细胞进行计数。
12. 在 N2 培养基中以 1 x 10⁷ 个细胞/mL 的浓度重悬细胞，并以 150,000 - 200,000 个细胞/cm² 的细胞密度接种 ESN。
13. 将新铺板的 ESN 转移到 37 °C 和 5% CO₂ 的加湿组织培养箱中，并保持如第 3 节所示。

2. 准备用于在 DIV 0 接种神经前体的培养表面

1. 至少在铺板前 1 天准备组织培养处理的培养皿。加入足够的聚乙烯亚胺（PEI;在无菌 H₂O中为 25 μg/ml）或聚-D-赖氨酸（PDL;在无菌 H₂O 中为 100 μg/ml）以覆盖经组织培养处理的塑料培养皿，并在 37 °C 下孵育 O/N。
2. 装盘当天早上，用双蒸 H₂O 洗碗两次，用 PBS 洗一次。最后一次洗涤后，加入足够的 N 2 培养基以覆盖培养皿（例如，12 孔培养皿每孔 1 mL 或每 6 cm 培养皿 4 mL）。
至少
3. 在神经元电镀前一天准备 18 mm 玻璃盖玻片。通过等离子清洁清洁盖玻片 4 分钟。
4. 立即将清洁的盖玻片转移到大无菌培养皿底部的乙醇洗涤封口膜中，并加入 400 μl PEI 或 PDL 溶液，如步骤 2.1 所示制备。在组织培养箱中于 37 °C 孵育 O/N。
5. 早上，用水洗涤盖玻片 3 次，并在 37 °C 下加入 5 μg/ml 层粘连蛋白的 PBS 溶液 1 - 3 小时。在解离神经元之前，吸出层粘连蛋白并立即将盖玻片转移到含有 1 ml NPC 培养基的 12 孔培养皿的孔中，确保处理面朝上。
6. 将培养皿和盖玻片储存在 37 °C，直到 NPC 准备好装板。

3. 神经元的维持

1. 在 DIV 1 处，吸出培养基并替换为 N2 培养基。
2. 在 DIV 2 和 4 处，吸出培养基并替换为 B27 培养基。
3. 在 DIV 8 处，吸出培养基并替换为含有有丝分裂抑制剂的 B27 培养基，以消除污染的非神经元细胞。
4. 在 DIV 12 处，更换为 B27 培养基。
在
5. 准备使用之前，请勿从 5% CO₂ 中去除 DIV 12⁺ ESN。

结果

图 1.悬浮适应的 ESN 保持有丝分裂稳定并表达多能性标志物。（A） ESC 维护和区分示意图。视黄酸 （RA） 或白血病抑制因子 （LIF） 的存在与否用 + 或 – 标记。提供了原代神经元培养物的体外天数 （DIV） 和经典发育阶段 （DS） 之间的比较。（B） 过渡到悬浮培养后，R1、D3 和 C57BL/6J ES 细胞系的增殖速率稳定了 5 次传代。（C） 流式细胞术数据显示，在悬浮培养物中测得的 R1、D3 和 C57BL/6J ES 细胞系中，Oct3/4 表达在 25 次传代中没有实质性变化（每个传代 n = 6）。（D） 在第 5 次和第 30 次传代之间测量的悬浮适应的 R1 ESC 细胞系的常规传代期间的实际细胞产量（黑线）。如果...

材料