将小鼠胚胎干细胞分化为联网神经元群

Abstract

来源:Hubbard， K. et al.， 干细胞衍生的中枢神经系统神经元网络培养物中生物神经毒素的功能评估。J. Vis. Exp. （2015 年）。

该视频演示了一种将胚胎干细胞分化为具有功能突触的网络神经元群的技术。它概述了胚胎干细胞分化为神经元、诱导神经元网络形成以及用网络神经元富集培养物所涉及的步骤。

Protocol

1. 神经元分化

注意:在中午之前执行步骤 1.1 - 1.5，在中午之后执行步骤 1.7。图 1A 显示了区分程序的概述。

1. 将 350 μl （3.5 x 10，⁶） 的 ESC 转移到含有 25 ml 分化培养基的 10 cm 低附着培养皿中。置于设置为 30 - 45 rpm 的轨道振荡器上，置于 37 °C 和 5% CO₂ 的组织培养箱内。这是分化的第一天，称为体外日（DIV）-8.
   注意:使用超低附着培养皿会增加该方法的成本，但产生的产量比细菌培养皿略高，因为聚集体偶尔会粘附在培养皿上。如果首选不同的培养皿大小，则可以相应地缩放中等体积和细胞数。
2. 48 小时 （DIV -6） 后，使用 25 ml 移液管将分化细胞聚集体转移到 50 ml 锥形管中。立即向培养皿中加入新鲜的 25 ml 分化培养基。
3. 让聚集体在 2 - 5 分钟内沉降，产生 1 - 2 mm 深的可见颗粒。忽略悬浮液中残留的单个细胞或小聚集体。小心吸出培养基，并使用 P1000 将细胞沉淀转移回培养皿中。放在组织培养箱中的旋转振荡器上。
4. 在 DIV -4 处，重复步骤 1.2。颗粒深 2 - 4 mm。将补....

Results

图 1.悬浮适应的 ESN 保持有丝分裂稳定并表达多能性标志物。（A） ESC 维护和区分示意图。视黄酸 （RA） 或白血病抑制因子 （LIF） 的存在与否用 + 或 – 标记。提供了原代神经元培养物的体外天数 （DIV） 和经典发育阶段 （DS） 之间的比较。（B） 过渡到悬浮培养后，R1、D3 和 C57BL/6J ES 细胞系的增殖速率稳定了 5 次传代。（C） 流式细胞术数据显示，在悬浮培养物中测得的 R1、D3 和 C57BL/6J ES 细胞系中，Oct3/4 表达在 25 次传代中没有实质性变化（每个传代 n = 6）。（D） 在第 5 次和第 30 次传代之间测量的悬浮适应的 R1 ESC 细胞系的常规传代期间的实际细胞产量（黑线）。如果.......

Materials