将小鼠胚胎干细胞分化为神经元网络群体

摘要

来源：Hubbard, K. 等，利用干细胞衍生的中枢神经系统神经元网络化培养物对生物神经毒素进行功能评估。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了一种将胚胎干细胞分化为具有功能性突触的神经元网络群体的技术。该方法概述了胚胎干细胞向神经元分化的步骤、神经元网络形成的诱导过程，以及培养物中网络化神经元的富集方法。

方案

1. 神经元分化

注意：步骤 1.1 至 1.5 需在中午前完成，步骤 1.7 需在中午后进行。分化流程的概览见图 1A。

1. 转移 350 µl（3.5 × 10⁶ 个细胞）至 1.5 ml 离心管中⁶将ESCs接种至含25 ml分化培养基的10 cm低黏附培养皿中。置于37 °C、5% CO₂的细胞培养孵育箱内，设置摇床转速为30 - 45 rpm。₂这是分化的第一天，称为第1天 体外 （体外培养天数）-8
   注意： 使用超低吸附培养皿会增加该方法的成本，但与细菌培养皿相比可获得略高的产量，因为细胞聚集体有时会黏附在培养皿上。若偏好使用不同尺寸的培养皿，可相应调整培养基体积和细胞数量。
2. 48 小时后（DIV -6），使用 25 ml 移液管将正在分化的细胞团块转移至 50 ml 锥形管中。立即向培养皿中加入 25 ml 新鲜分化培养基。
3. 让聚集体静置沉淀 2 - 5 分钟，形成肉眼可见、深度为 1 - 2 mm 的沉淀物。悬浮液中残留的单细胞或少量小聚集体可忽略。小心吸除上清液，用 P1000 移液器将细胞沉淀转移回培养皿中。置于组织培养孵育箱内的旋转摇床上。
4. 在 DIV -4 时，重复步骤 1.2。沉淀物深度为 2–4 mm。向培养皿中加入 30 ml 含 6 µM 全反式维甲酸（RA）的分化培养基。放回组织培养孵箱中的旋转摇床，继续孵育 48 小时。
5. 在DIV -2时，重复步骤1.3。此时沉淀物深度为4–8 mm。
6. 在 DIV -1 时，按照第 2 节中的步骤准备铺板表面。
7. 在 DIV 0 时，将 5 ml 预先分装并冻存的 NPC 胰蛋白酶消化液于 37 °C 解冻 5–10 分钟，并置于组织培养超净台中。使用 25 ml 移液管将正在分化的细胞团转移至 50 ml 锥形管中。静置使细胞团沉降，小心吸除上清液。用 10 ml PBS 洗涤沉淀物两次，每次洗涤之间均静置使细胞团沉降。
8. 第二次 PBS 洗涤后，向沉淀中加入 5 ml NPC 消化培养基，在 37 °C 下孵育 5 分钟。孵育 2.5 分钟后，轻轻弹击离心管。
9. 加入5 ml 0.1% 大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）以灭活胰蛋白酶，通过倒置混匀。用10 ml血清移液管轻柔吹打10–15次，直至形成相对均一的细胞悬液。
10. 将细胞悬液缓慢转移至置于50 ml锥形管顶部的40 µm或70 µm细胞筛中。待全部悬液过滤后，加入1 ml N2培养基冲洗残留细胞通过滤膜，随后在200 × g条件下离心6分钟，收集解离的细胞悬液。
11. 吸弃上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用10 ml N2培养基洗涤细胞两次，每次以200 × g离心5分钟收集细胞，两次洗涤之间用P1000移液器吹打重悬。第二次洗涤前，使用血细胞计数板对细胞进行计数。
12. 用 N2 培养基重悬细胞，密度为 1 × 10⁷ 每毫升细胞数，并以每平方厘米150,000 - 200,000个细胞的密度接种ESN².
13. 将新铺板的ESNs转移至37 °C、5% CO₂的湿化组织培养孵箱中₂ 并按照第3节中的要求进行维持。

2. 在 DIV 0 时准备用于接种神经前体细胞的培养表面

1. 至少在铺板前1天准备经组织培养处理的培养皿。加入足量的聚乙烯亚胺（PEI；25 µg/ml，溶于无菌H₂O) 或聚-D-赖氨酸（PDL；100 µg/ml，溶于无菌 H₂O）覆盖经组织培养处理的塑料培养皿，于 37 °C 培养过夜。
2. 铺板当天早晨，用双蒸水将培养皿洗涤两次₂O 和 PBS 各一次。最后一次洗涤后，加入足量 N2 培养基以覆盖培养皿（例如， 12孔板每孔1 ml，或6 cm培养皿每皿4 ml。
3. 至少在神经元接种前一天准备18 mm玻璃盖玻片。使用等离子清洗仪清洗盖玻片4分钟。
4. 立即将清洗后的盖玻片转移至大号无菌培养皿底部预先用乙醇清洗过的Parafilm膜上，加入400 µl按步骤2.1配制的PEI或PDL溶液。在37 °C细胞培养孵箱中孵育过夜。
5. 清晨，用去离子水洗涤盖玻片三次，随后在 PBS 中加入终浓度为 5 µg/ml 的层粘连蛋白（laminin），于 37 °C 孵育 1 - 3 小时。在分离神经元前，吸除层粘连蛋白溶液，立即将盖玻片转移至含有 1 ml NPC 培养基的 12 孔板中的一个孔内，注意保持处理面朝上。
6. 将培养皿和盖玻片保存在 37 °C，直至神经前体细胞准备铺板。

3. 神经元的维持

1. 在DIV 1时，吸除培养基，并更换为N2培养基。
2. 在DIV 2和DIV 4时，吸除培养基，并更换为B27培养基。
3. 在DIV 8时，吸除培养基，并更换为含有有丝分裂抑制剂的B27培养基，以清除污染的非神经元细胞。
4. 在DIV 12时，更换为B27培养基。
5. 在准备使用前，不要将DIV 12⁺ ESNs从5% CO₂环境中移出。

结果

图 1. 悬浮培养适应的 ESNs 保持有丝分裂稳定性并表达多能性标志物。 （A）ESC 维持与分化的示意图。维甲酸（RA）或白血病抑制因子（LIF）的存在或缺失以 + 或 – 标注。体外培养天数（DIV）与原代神经元培养的经典发育阶段（DS）之间的对应关系已提供。（B）R1、D3 和 C57BL/6J ES 细胞系在转为悬浮培养后，经过五次传代，增殖速率趋于稳定。（C）流式细胞术数据显示，在悬浮培养中连续传代 25 次期间，R1、D3 和 C57BL/6J ES 细胞系的 Oct3/4 表达未发生显著...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018	培养基：ESC培养基 配方与备注：500 mL
100x MEM NEAA	Life Technologies	11140-050	培养基：4 °C保存，最长1个月 配方与备注：6 mL
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine	ATCC	30-2115	6 mL
ES认证FBS	Applied Stem Cell	ASM-5007	90 mL
100x 抗生素	Sigma-Aldrich	A5955	3 mL
55 mM 2-巯基乙醇	Life Technologies	21985-023	1.1 mL
107 单位/mL LIF	Millipore	ESG1107	60 μL
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018	培养基：ESC分化培养基 配方与备注：436.6 mL
100x MEM NEAA	Life Technologies	11140-050	培养基：4 °C保存，最长1个月 配方与备注：5 mL
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine	ATCC	30-2115	5 mL
ESC认证血清	Applied Stem Cell	ASM-5007	50 mL
100x 抗生素	Sigma-Aldrich	A5955	2.5 mL
55 mM 2-巯基乙醇	Life Technologies	21985-023	0.9 mL
Dulbecco's PBS	Sigma-Aldrich	D8537	培养基：NPC胰蛋白酶消化培养基 配方与备注：100 mL
0.5 M EDTA (18.3%)	Sigma-Aldrich	3690	培养基：分装后冻存，每份5 mL 配方与备注：0.266 mL
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T8802	50 mg
聚乙烯亚胺（PEI）	Sigma-Aldrich	P3143	培养基：表面包被溶液 配方与备注：H2O中配制成2.5 µg/mL
聚-D-赖氨酸（PDL）	Sigma-Aldrich	P7280	培养基：1周内使用 配方与备注：H2O中配制成100 µg/mL
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020	H2O中配制成5 µg/mL
DMEM/F12 + GlutaMAX	Life Technologies	10565-018	培养基：NPC培养基 配方与备注：492.5 mL
100x N2维生素	Life Technologies	17502-048	培养基：4 °C保存，最长1个月 配方与备注：5 mL
100x 抗生素	Sigma-Aldrich	A5955	2.5 mL
Neurobasal A	Life Technologies	10888-022	培养基：ESN培养基 配方与备注：482.5 mL
50x B27维生素	Life Technologies	17504-044	培养基：4 °C保存，最长1个月 配方与备注：10 mL
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine	ATCC	30-2115	5 mL
100x 抗生素	Sigma-Aldrich	A5955	2.5 mL
5-氟-2'-脱氧尿苷（5FDU）	Sigma-Aldrich	F0503	培养基：有丝分裂抑制剂，2000倍浓缩液，分装后-20 °C保存 配方与备注：将150 mg 5FDU和350 mg尿苷溶于10 mL Neurobasal A中。无菌过滤，分装并冻存。在ESN培养基中使用2000倍稀释液。
尿苷	Sigma-Aldrich	U3003
TrypLE Express胰蛋白酶	Life Technologies	12605-010	培养基：其他 配方与备注：室温保存
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	室温保存
大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）	Sigma-Aldrich	T6414	-20 °C保存
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023	室温保存
抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A4403	将100 mg抗坏血酸溶于5.7 mL DMSO/乙醇（50:50）混合液中，配制成100 mM储备液。
视黄酸（RA）	Sigma-Aldrich	R2625	将15 mg RA溶于9 mL DMSO/乙醇（50:50）混合液中，加入1 mL 100 mM抗坏血酸储备液。分装后-80 °C保存。可稳定保存6个月。
等离子清洗仪	Harrick Plasma	PDC-32G
Olympus IX51倒置显微镜	Olympus	N/A
18 mm玻璃盖玻片	Fisher	12-545-84
细胞筛（40 µm）	Fisher	08-771-1
Stovall Belly Dancer摇床	Fisher	15-453-211
低吸附培养皿	Fisher	05-539-101	Corning 3262
细菌培养皿	VWR	25384-302	100 x 15 mm