从小鼠坐骨神经中磁分离雪旺细胞

摘要

来源：Blusch, A.，等，大鼠背根神经节外植体与施万细胞共培养体系中周围神经轴突的体外髓鞘形成。J. Vis. Exp. (2023)

本视频展示了一种从小鼠坐骨神经纤维中分离施万细胞的方法。

方案

1. 施万细胞培养

1. 雪旺细胞培养包被
   1. 在无菌条件下对细胞培养皿进行包被。向两个60 mm的组织培养（TC）皿中各加入2 mL的0.01%多聚赖氨酸（PLL），于4 °C孵育过夜。
   2. 移除PLL，用去离子水洗涤TC皿2次，然后加入2 mL浓度为1 µg/cm²的层粘连蛋白，于4 °C孵育过夜。再用去离子水洗涤TC皿2次，让培养皿自然风干。
2. 雪旺细胞培养基的配制
   1. 在无菌条件下，向50 mL的Dulbecco′s改良Eagle′s培养基（DMEM）/F-12（高糖）中加入10%热灭活胎牛血清（FCS）、2 µM佛司可林（forskolin）、10 nM神经调节蛋白（neuregulin）和50 µg/mL庆大霉素，配制成雪旺细胞培养基。
   2. 在无菌条件下，向70 mL Leibovitz's L-15培养基中加入50 µg/mL庆大霉素。
3. 坐骨神经的酶消化
   ​注意：以下步骤均在无菌条件下操作。
   1. 在10 mL DMEM（高糖）中配制含0.25% dispase II、0.05% I型胶原酶和50 µg/mL庆大霉素的酶消化液。
   2. 在4 °C下以188 x g离心5分钟，用25 mL移液管吸除上清液，并用1,000 µL移液器将沉淀连同残留的Leibovitz's L-15培养基转移至一个60 mm组织培养皿中。
   3. 用10 mL酶消化液冲洗50 mL离心管，并将液体加入含有神经纤维的培养皿中。用移液器枪头小心地在培养皿中分散组织，以最大化暴露可用于消化的表面积。
   4. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育18小时，然后加入10 mL含40% FCS的Hanks平衡盐溶液（不含Ca²⁺和Mg²⁺，HBSS）以终止消化反应。
4. 细胞分离
   1. 用移液管将消化后的神经组织转移至50 mL离心管中，在4 °C下以188 x g离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于10 mL含10% FCS和50 µg/mL庆大霉素的DMEM中。依次使用10 mL、5 mL、2 mL、1 mL和200 µL的移液器枪头各吹打重悬20次。
   2. 将细胞悬液通过100 µm细胞筛过滤，然后在4 °C下以188 x g离心10分钟。弃去上清液，将沉淀用4 mL含10% FCS和50 µg/mL庆大霉素的DMEM重悬。
   3. 将2 mL细胞悬液分别加入两个经PLL和层粘连蛋白包被的60 mm TC培养皿中，置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育。孵育期间静置培养皿2天，避免机械扰动，以促进细胞贴壁。
5. 雪旺细胞分化
   1. 培养2天后，移除培养基，用含10% FCS和50 µg/mL庆大霉素的DMEM（高糖）小心洗涤培养皿2次。随后加入2 mL雪旺细胞培养基。每隔两天更换一次培养基，并在显微镜下观察细胞形态和融合度。
6. 细胞胰蛋白酶消化与磁珠分选
   1. 当细胞融合度达到约80%（培养6–12天）时，用3 mL DPBS小心洗涤培养皿2次，然后加入2 mL预热至37 °C的0.05%胰蛋白酶/EDTA，孵育3分钟。待细胞从培养皿底部脱落时，加入2 mL含10% FCS和50 µg/mL庆大霉素的DMEM以终止消化。
      注意：胰蛋白酶消化时间必须严格控制为3分钟，之后应迅速进行后续操作。
   2. 将细胞沉淀重悬于2 mL磁珠分选缓冲液中（含0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 nM EDTA的DPBS）。取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝混合，使用细胞计数板进行细胞计数。
   3. 在4 °C下以188 x g离心10分钟，将细胞沉淀按每1×10⁷个细胞用90 µL磁珠分选缓冲液重悬。每1×10⁷个细胞加入10 µL Thy-1微珠。反复吹打混匀数次，在8 °C避光孵育15分钟。
   4. 向细胞悬液中加入2 mL磁珠分选缓冲液，在4 °C下以300 x g离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于500 µL磁珠分选缓冲液中。
   5. 用1 mL磁珠分选缓冲液润湿磁珠分选柱，将分选柱置于磁力架中。将细胞悬液加至分选柱中，收集流出液，并在4 °C下以300 x g离心10分钟。
      ​注意：成纤维细胞被正向富集并保留在柱内，而雪旺细胞则通过分选柱流出。成纤维细胞可用推杆洗脱收集（例如作为雪旺细胞染色方案的阴性对照）。
   6. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL共培养基中。经台盼蓝染色后使用细胞计数板进行细胞计数。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8076.4
细胞筛，100 µM	BD Bioscience, Heidelberg, Germany	352360
离心机 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	5811000015
CO2 培养箱 Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Dispase II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	4942078001
蒸馏水（纯水系统）	Millipore, Molsheim, France	ZLXS5010Y
DMEM/F-12，含 GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	31331093
DPBS（不含钙离子和镁离子）	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D8537-6X500ML
FCS	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F7524	FCS 必须经过雪旺细胞培养测试
庆大霉素	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	5710064
HBSS（不含钙离子和镁离子）	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	14170138
层粘连蛋白	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	L2020-1MG
MACS 多功能支架	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130042303
显微剪刀	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15000-08
显微镜	Motic, Wetzlar, Germany	Motic BA 400
载玻片	VWR, Radnor, USA	630-1985
MiniMACS 分离器	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130091632
MS 柱	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-201
Neubauer 计数板	Assistant, Erlangen, Germany	40441
移液器	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	2231300004
聚-L-赖氨酸	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P4707-50ML
血清移液管，10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861254025
血清移液管，25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861685001
血清移液管，5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861253001
TC 培养皿 60，细胞+	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833901300
Thy-1 磁珠（MACS 试剂盒）	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-094-523
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25300-054
I 型胶原酶	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	C1639
水浴锅 1008 型	GFL, Burgwedel, Germany	4285