获取小鼠海马水平脑切片

摘要

来源：Van Hoeymissen, E.，等。小鼠脑水平海马切片。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种制备小鼠水平海马脑切片的详细方案，重点在于保持海马纤维通路的完整性。该过程包括仔细地将脑组织沿中线切开并固定，使用振动切片机进行切片，并通过通入碳氧混合气体的液体维持组织的最佳状态，最终获得可用于进一步实验的海马脑切片。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 高蔗糖切片溶液和人工脑脊液（ACSF）的配制

1. 实验前准备
   1. 使用实验室一级纯水配制1 L的10倍切片预溶液，其中含有（单位为 mM）：25 KCl、20 CaCl₂、10 MgSO₄、12.5 KH₂PO₄（表1）。为防止磷酸钙沉淀，先在烧杯中加入800 mL H₂O，然后在磁力搅拌器持续搅拌下缓慢加入上述化学试剂。溶液可储存于4 °C或室温（RT）条件下。
2. 实验当天
   1. 使用实验室一级纯水配制1 L的1倍人工脑脊液（ACSF），其中含有（单位为 mM）：125 NaCl、2.5 KCl、2 CaCl₂、1 MgSO₄、1.25 NaH₂PO₄、26 NaHCO₃、25 葡萄糖（表2）。使用蒸汽压渗透压仪测定其渗透压，确保在305–315 mOsm之间（pH值约为7.55–7.6）。
      注意：为防止磷酸钙沉淀，先在烧杯中加入800 mL H₂O，然后在磁力搅拌器持续搅拌下缓慢加入所有固体试剂。最后再缓慢滴加1 M储备液中的MgSO₄和CaCl₂至所需量。
   2. 在室温（RT）下持续用碳合气（carbogen）鼓泡1倍ACSF溶液，使其pH值维持在7.3–7.4之间。
      注意：若pH值略高或略低，可通过调节碳合气鼓泡强度进行微调。若在碳合气作用下pH仍高于7.45，可滴加几滴1 M NaH₂PO₄溶液进行调节。
   3. 为每只动物的大脑准备250 mL的1倍高蔗糖切片溶液：在烧杯中加入25 mL 10倍切片预溶液，并添加（单位为 mM）：252 蔗糖、26 NaHCO₃、10 葡萄糖（表3）。确认其渗透压在320–325 mOsm之间（pH值约为7.55–7.6）。
   4. 用碳合气对高蔗糖切片溶液鼓泡10–15分钟，使其pH值控制在7.3–7.4之间。
      注意：若在碳合气作用下pH高于7.45，可滴加几滴1 M KH₂PO₄溶液进行调节。
   5. 将高蔗糖切片溶液置于超低温冰箱（-80 °C）中冷冻20–30分钟，直至其部分结冰。

2. 小鼠脑组织的解剖与定位

1. 将脑组织转移至预冷的35 mm培养皿中，用盛有ACSF的巴斯德吸管轻轻冲洗脑组织，去除所有毛发或血粒（血液对脑组织具有细胞毒性作用）。
2. 借助解剖铲将脑组织转移至置于预冷90 mm培养皿上方的浸湿滤纸上（图1A）。
3. 使用刀片将脑组织从中间切开，分离两个半球，并将两个半球均切面朝下放置。
4. 使用刀片平行于背侧顶端切除每个半球背侧部分（5%–10%），然后将两个半球均以腹侧朝上的方向放置在新切的切面上（图1C）。
5. 在样品板上滴加一滴超级胶水，并用移液器吸头将其均匀涂抹，以便容纳两个脑半球。
6. 使用滤纸条通过毛细作用力拾取一个脑半球：将滤纸条接触半球的腹侧面，从而避免损伤组织。
7. 使用另一条滤纸条小心地将脑半球的背侧部分半干燥，然后将半球背侧朝下放置在样品板的胶水上。对第二个半球重复相同操作。
   注意：两个脑半球应在振动切片机载物板上呈水平对称镜像排列，头端朝外，尾端相对（但不接触）位于中央。两个半球的内侧面应朝向振动切片机刀片，外侧面朝向实验操作者（图1D）。
8. 将样品板放入切片室，并迅速而小心地用冰冻的高蔗糖切片液冰浆覆盖。一旦溶液接触到胶水，胶水将迅速固化，从而将脑半球牢固地粘附在样品板上。
9. 确保脑半球完全被高蔗糖切片液覆盖，并确认溶液正用碳氧混合气（carbogen）持续通气。
   注意：整个解剖过程应尽可能快速完成。请确保脑组织在无氧供应状态下的时间不要过长。从断头到脑组织浸入高蔗糖切片液冰浆的过程应控制在约1–1.5分钟内。这是制备高质量急性脑切片最关键的条件。

3. 脑组织的水平切片

1. 将振动切片机刀片置于半球内侧前方，并将其降低至与现在朝上的半球腹侧相同高度。借助振动切片机控制装置，将刀片进一步向背侧降低600 µm，然后开始切片。刀片应接触到组织（若未接触，可反转刀片并再略微降低）。持续切片，直至前两片完全与两个半球分离。
2. 反转刀片，再降低300 µm，再次进行切片。
3. 当海马结构变得可见时（如有需要，可参考小鼠脑图谱）（图1E），使用加宽的塑料巴斯德吸管收集切片。持续收集切片，直至尾状壳核在海马旁显现为止。通常，从小鼠脑中可收集到8–12片300 µm厚的切片（每半球4–6片）。
4. 使用塑料巴斯德吸管收集切片，并将其转移至水浴中的恢复室（图1F）（每次切片后立即收集，以防止切片在切片室中漂浮）。
   注意：操作应尽可能迅速，并确保整个过程中高蔗糖切片液保持冰冻且通入碳氧混合气体（carbogen）。如有需要，及时补充切片室周围的冰块。

4. 用于电生理记录的脑切片的恢复

1. 将切片置于盛有ACSF的恢复室中，在32 °C水浴中孵育1 h。
   注意：恢复室也可从商业途径获得。
2. 将恢复室从水浴中取出。
3. 在开始任何进一步操作前，将切片在室温下再放置至少30 min以继续恢复。

缓冲液与培养基配方。

表1：10倍切片预溶液（1 L）。

化合物	浓度 (mM)	分子量 (g/mol)	质量 (g)
KCl	25	74.55	1.86
CaCl2 * 2H2O	20	147.01	2.94
MgSO4 * 7H2O	10	246.48	2.46
KH2PO4	12.5	136.08	1.7

表2：1x ACSF（1 L）（渗透压介于305–315 mOsm之间）。

化合物	浓度 (mM)	分子量 (g/mol)	用量 (g)
NaCl	125	58.44	7.3
KCl	2.5	74.55	0.19
CaCl2 * 2H2O	2	来自 1 M CaCl2 溶液	2 mL
MgSO4 * 7H2O	1	来自 1 M MgSO4 溶液	1 mL
NaH2PO4 * 2H2O	1.25	156.02	0.2
NaHCO3	26	84.01	2.18
Glucose * H2O	25	198.17	4.95

表3：1×高蔗糖切片溶液（250 mL）（渗透压介于320–325 mOsm之间）。

化合物	浓度 (mM)	分子量 (g/mol)	用量 (g)
10x 切片预溶液	N/A	N/A	25 mL
蔗糖	252	342.3	21.57
NaHCO3	26	84.01	0.55
葡萄糖 * H2O	10	198.17	0.49

结果

图1：水平海马脑切片制备的详细信息。（A）用于啮齿类动物脑组织解剖和切片的工具图像：（a）长约±2 cm、宽约±0.5 cm的滤纸条（例如，413号滤纸）；（b）刀片；（c）超级胶水；（d）移液器吸头；（e）样本台（随振动切片机配备）；（f）35 mm培养皿；（g）细毛刷；（h）刮勺；（i）弯头镊子；（j）解剖剪刀；（k）强力剪刀（刀刃长度超过10 cm）；（l）开口较宽的塑料巴斯德吸管（直径介于0.6至0.8 cm之间）；（m）恢复室（自制，使用250 mL烧杯、塑料环、尼龙网和一段10 mL移液管）；（n）盛有冰块的90 mm培养皿，以及（o）置于冷藏培养皿上方的滤纸片。（B）振动切片机照片，其中（a）为装有冰块的切片室支架；（b）切片室；（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Carbogen 气罐	Air Liquide	Alphagaz mix B50	气体混合物 CO2/O2：5/95，纯度等级 5
培养皿（35 mm）	Corning Life Sciences	353001	https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001
培养皿（90 mm）	Thermo Fisher Scientific	101VR20	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20
弯头镊子	Fine Science tools	11270-20	https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20
D-(+)-葡萄糖一水合物	Sigma Aldrich	16301	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en&region=BE
滤纸	VWR	516-0818	等级 413
细毛刷	Raphael Kaerell	8204	尺寸 #1
Loctite 406	Henkel Adhesive technologies	Loctite 406	快干胶
氯化钾	Chem-lab	CL00.1133	https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528
磷酸二氢钾	Merck	104873	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
用于制备半脑的剃刀刀片	SPI supplies	Safety Cartridge Dispenser - Pkg/10	GEM 科学单边剃刀刀片
用于振动切片机的剃刀刀片	Ted Pella Inc	121-6	双面可折式剃刀刀片（聚四氟乙烯涂层不锈钢）
恢复室	自制 - 通用	N/A	用于收集和保存脑切片（详见文稿说明）
剪刀	任意厂商	N/A	刀刃应锋利，长度至少 15 cm，便于断头操作
二水合磷酸二氢钠	Merck	106342	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
碳酸氢钠	Alfa Aesar	14707	https://www.alfa.com/en/catalog/014707/
氯化钠	Fisher Scientific	S/3160/60	https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420
刮勺	Sigma Aldrich	S9147-12EA	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en&region=BE
蔗糖	VWR International Ltd.	102745C	https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf
用于 Carbogen、灌流和抽吸管路的管路 1	Warner Instruments	64-0167	Tygon 管（TY-50），适用于标准阀门系统
用于 Carbogen、灌流和抽吸管路的管路 2	Fisher Scientific	800/100/200 & 800/100/280	Smiths Medical Portex 细孔径 LDPE 管
振动切片机	Leica	14912000001	半自动振动刀片切片机 VT1200
水浴锅	Memmert	WNB 7	https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf
水纯化系统	Merck	Synergy millipore	用于获得高纯度水