从小鼠脑中制备倾斜的杏仁核脑片

摘要

来源：Bosch, D. 等. 离体 光遗传学解析脑切片中的恐惧环路 J. Vis. Exp. (2016)

该视频展示了从小鼠脑中制备斜位杏仁核脑片的方法。将脑组织以一定角度放置在振动切片机的样本台上，以获取包含杏仁核以及来自内侧前额叶皮层并与其形成突触连接的轴突的脑片。脑片保持在生理温度下，以维持组织活性，供后续实验使用。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 急性切片的制备

1. 准备人工脑脊液（ACSF）、切割液、器械（剪刀、手术刀、镊子、刮勺、巴斯德吸管）以及琼脂块。
   注意： 每次实验需准备 1 L 人工脑脊液（ACSF），按先前发表的方法将化学试剂溶解于双蒸水（H₂O）中配制。切割液通过向 200 ml ACSF 中添加 0.87 ml 的 2 M MgSO₄ 储存液配制而成。
2. 在整个实验过程中，使用 95% O₂ 和 5% CO₂ 对 ACSF 和切割液进行氧合。
3. 使用小动物麻醉机以异氟烷（氧气中浓度 3%）对小鼠进行深度麻醉。在继续操作前，通过肢体回缩反射检查麻醉深度。
4. 使用大剪刀将小鼠断头，并立即将头部浸入冰冻的切割液中冷却。
5. 从尾侧至头侧沿中线做单一切口打开颅骨，用镊子轻轻将颅骨碎片向两侧推开。使用小型圆头刮勺轻柔地将脑组织从颅腔中取出，并迅速用手术刀切除小脑。将脑组织置于冰冻的切割液中。
6. 对于内侧前额叶皮层（mPFC）注射位点：使用手术刀切下脑的前部（包含 mPFC），并置于冰冻切割液中，待后续切片。
7. 用滤纸吸去多余的切割液，将脑组织后部粘附至振动切片机载物台上。
8. 对于倾斜切片的杏仁核切片，将脑组织粘附于一块以 35° 角切割的 4% 琼脂块上（图 1D，中）。对于冠状面杏仁核切片、内侧膝状体/后丘脑板内核（MGm/PIN）注射位点以及 mPFC 注射位点，直接将脑组织粘附于载物台上（图 1D，左和右）。在切片过程中，于脑组织后方放置额外的琼脂块以增强稳定性。
9. 将载物台放入切割室，切割室内盛有冰冻且持续氧合的切割液，并通过冷却装置维持温度在 4 °C。使用蓝宝石刀片制备急性杏仁核切片（厚度 320 µm）。将切片转移至界面型孵育室，室中充满氧合的 ACSF 并在室温（RT）下保存。
10. 制备急性杏仁核切片后，将界面型孵育室置于 36 °C 水浴中孵育 35–45 分钟以使切片恢复。随后将孵育室移回室温环境。
11. 在开始步骤 1.10 的同时，按照前述急性杏仁核切片的方法（步骤 1.8–1.9）对注射位点区域进行切片。此处无需在水浴中孵育恢复切片。可选： 为快速估计注射位点位置，可在配备荧光灯及合适滤光片组的体视显微镜下观察切片。

结果

图1. 立体定向注射、急性脑切片制备及突触前纤维的可视化。 (A, B) 立体定向病毒注射。A) 小鼠麻醉后固定于立体定向仪中，暴露颅骨并插入注射移液管的照片。插图：充满混合快绿的病毒溶液的注射移液管放大图。比例尺：3 mm。(B) 小鼠颅骨示意图，标示不同注射区域的钻孔位置。(C) 本研究中使用的不同病毒构建体示意图。深灰色：启动子序列；蓝色：通道视紫红质2（ChR2 (H134R)）；绿色/红色：荧光蛋白。局部杏仁核投射的表达时间为2周，mPFC和MGm/PIN投射的表达时间为4–6周。(D) 急性脑切片制备：示...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人工脑脊液（ACSF）
膜片钳内液
七水硫酸镁	Roth, Germany	P027.1	用纯水配制2M储存液
组织切片机，Microm HM650V	Fisher Scientific, Germany	920120
组织切片机冷却装置，CU65	Fisher Scientific, Germany	770180
蓝宝石刀片	Delaware Diamond Knives		定制订购，请联系公司咨询
体视显微镜，SZX2-RFA16	Olympus, Japan
膜片钳显微镜，BX51WI	Olympus, Japan
浴槽温度控制器，TC05	Luigs & Neumann, Germany	200-100 500 0145
用于界面式孵育槽的硝酸纤维素滤纸	Satorius Stedim Biotech, Germany	13006--50 ACN