从小鼠脑中制备暴露杏仁核区域的冠状脑切片

摘要

来源：Bosch, D.，等。脑切片中恐惧环路的离体光遗传学解析。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了从小鼠脑中制备薄冠状脑切片的过程，暴露出富含来自内侧前额叶皮层突触连接的杏仁核区域。随后将切片置于充氧的人工脑脊液中恢复，以维持神经元的活性。

方案

1. 急性切片的制备

1. 准备人工脑脊液（ACSF）、切割溶液、工具（剪刀、手术刀、镊子、刮勺、巴斯德移液管）和琼脂块。
   注意： 每次实验需要1 L人工脑脊液（ACSF）。根据先前发表的方法，将化学试剂溶解于双蒸水中制备ACSF。切割溶液通过在200 ml ACSF中加入0.87 ml的2 M MgSO₄储备液配制而成。
2. 在整个实验过程中，使用95% O₂和5% CO₂对ACSF和切割溶液进行氧合。
3. 使用小型动物麻醉机以异氟烷（3%氧气）深度麻醉小鼠。在继续操作前，通过肢体回缩反射检查麻醉深度。
4. 使用大剪刀将小鼠断头，并立即将头部浸入冰冻的切割溶液中冷却。
5. 从尾侧向头侧沿中线做单一切口打开颅骨，用镊子轻轻将颅骨碎片向两侧推开。使用小型圆头刮勺轻柔地将脑组织提起并迅速取出。用手术刀切除小脑。将脑组织置于冰冻的切割溶液中。
6. 对于mPFC注射位点，使用手术刀切除脑的前部（包含mPFC），并在切片前将其保存于冰冻的切割溶液中。
7. 用滤纸吸去多余的切割溶液，并将脑组织的后部粘附到振动切片机的载物台上。
8. 对于冠状杏仁核切片、MGm/PIN注射位点以及mPFC注射位点，直接将脑组织粘接到载物台上（图1D，左和右）。在切片过程中，在脑组织后方放置额外的琼脂块以增强稳定性。
9. 将载物台放入切割室，切割室内盛有由冷却装置维持在4 °C的冰冻氧合切割溶液。使用蓝宝石刀片制备杏仁核的冠状切片。将切片置于持续通入氧合ACSF的界面式孵育室中，于室温下保存。

结果

图1. 立体定位注射、急性脑切片制备及突触前纤维的可视化。 (A, B) 立体定位病毒注射。A) 小鼠在立体定位仪中的照片，小鼠已麻醉，颅骨暴露，并插入注射移液管。插图：充满病毒溶液与快绿染料混合液的注射移液管局部放大图。比例尺：3 mm。(B) 小鼠颅骨示意图，标示了不同注射区域钻孔的位置。(C) 本研究所用不同病毒载体的示意图。深灰色：启动子序列；蓝色：通道视紫红质2（ChR2 (H134R)）；绿色/红色：荧光蛋白。局部杏仁核投射的表达时间为2周，mPFC和MGm/PIN投射的表达时间为4–6周。(D) 急性脑切片...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人工脑脊液（ACSF）	成分见参考文献 #16 和 #23
膜片钳内部灌注液	成分见参考文献 #16 和 #23
组织切片机，Microm HM650V	Fisher Scientific，德国	920120
组织切片机冷却装置，CU65	Fisher Scientific，德国	770180
蓝宝石刀片	Delaware Diamond Knives
体视显微镜，SZX2-RFA16	Olympus，日本