来源：Kerloch, T.，等。结合单核RNA测序的神经元荧光激活核负向分选用于研究海马神经发生微环境。J. Vis. Exp. (2022)。
该视频展示了一种从小鼠海马齿状回（DG）的胶质细胞和干细胞中分离完整细胞核的方法。将DG组织在冰冷的匀浆缓冲液中进行机械解离，以释放细胞核。弃去组织碎片及其他释放出的细胞器，细胞核经DNA染料以及与神经元核抗原（NeuN）特异性结合的荧光素标记抗体染色。随后采用荧光激活细胞核分选技术，分离出NeuN阴性的非神经元细胞核。
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方法文章
一种从海马齿状回非神经元细胞中分离细胞核的技术
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行
1. 齿状回的分离（耗时：15 分钟）
- 配制细胞核分离缓冲液1和2（NIM1和NIM2）、匀浆缓冲液（HB）以及洗涤液（WM）（表1）。将所有缓冲液、培养基、试剂和工具置于冰上，待用。在开始实验前至少1小时，将Dounce匀浆器（见材料表）置于冰上预冷。
注意：NIM1可配制后于4 °C保存最多6个月。NIM2、HB和WM应新鲜配制。
警告：操作二硫苏糖醇（DTT）、蛋白酶抑制剂和Triton X-100时需谨慎。这些化合物对皮肤和眼睛具有刺激性，急性毒性，并对水生环境有害。使用这些化学品时应佩戴防护手套、防护服及眼部和面部防护装置，操作后彻底洗手，并避免释放到环境中。 - 按照英国内政部Schedule 1操作规程，通过颈椎脱位法处死一只22月龄的雄性C57Bl/6J小鼠。
注意：有关本研究使用22月龄小鼠的理由，请参见讨论部分。然而，本方案可在整个生命周期的任何年龄阶段进行。 - 从小鼠体内取出脑组织，转移至一个盛有预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）的10 cm培养皿中（图1），并将培养皿置于冰上。使用解剖刀去除小脑，并沿矢状轴将大脑从两半球之间切开为两半。
- 另取一个10 cm培养皿，加入预冷的PBS并置于冰上。将其中一半脑组织转移至该培养皿中。在体视显微镜下分离出齿状回（DG），并重复此步骤以从另一半脑组织中获取第二个DG。
注意：上述步骤（步骤1.2–1.4）改编自先前描述的方法。此阶段应尽可能快速操作，以保持细胞完整性。 - 将两个DG组织转移至预冷的Dounce匀浆器中，并加入1 mL冷的HB缓冲液。
2. 组织解离、单细胞核分离及抗NeuN免疫染色（耗时：2小时）
- 使用松配合的“A”研杵轻轻研磨组织10次，随后使用紧配合的“B”研杵研磨15次。
注意：Dounce组织研磨应在冰上进行，研磨动作应轻柔，以减少因摩擦产生的热量和泡沫。所有缓冲液和设备均需预先冷却，并在整个操作过程中保持在冰上。 - 将匀浆液转移至预冷的15 mL离心管中；用1 mL冷HB缓冲液冲洗Dounce匀浆器，并将冲洗液合并至同一离心管中。向15 mL离心管中加入3 mL HB缓冲液，冰上孵育5分钟。轻轻倒置离心管混匀2次。
- 在50 mL试管上方，用0.5 mL HB缓冲液预湿70 µm滤网帽。将步骤2.2所得的细胞核悬液通过轻轻倾倒15 mL离心管的方式过滤至细胞滤筛中。用0.5 mL HB缓冲液冲洗滤网。
- 移除细胞滤筛，将试管在4 °C条件下以500 × g离心5分钟（使用摆桶式离心机）。弃去上清液。
注意：对匀浆液进行过滤有助于减少碎片，这对后续的流式细胞术和单细胞核RNA测序（snRNA-seq）步骤至关重要。 - 使用P1000移液器将沉淀物轻轻重悬于4 mL HB缓冲液中。冰上孵育5分钟。在4 °C条件下以500 × g离心10分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于3 mL WM缓冲液中。
- 在15 mL试管上方，用0.5 mL WM缓冲液预湿35 µm滤网帽。将步骤2.5所得的细胞核悬液通过细胞滤筛过滤，使用P1000移液器每次轻柔地移取0.5 mL进行操作。
- 用0.5 mL WM缓冲液冲洗滤网帽，将试管置于冰上。将滤液转移至新的15 mL离心管中，在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于3 mL WM缓冲液中。
- 在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于1 mL WM缓冲液中，其中包含鼠源抗神经元核抗原（NeuN）AlexaFluor 488标记抗体（anti-NeuN-AF488，1:32,000）和1 µg/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。冰上避光孵育45分钟。
注意：为优化分离细胞核的免疫染色效果，建议对抗体进行滴定，以确定流式细胞术分析和分选的最佳稀释比例。随后应运行足够的对照实验，以确认染色条件处于最佳状态。例如，使用偶联anti-NeuN-AF488抗体时，应设置阴性对照（即不加抗体，图2A）和阳性对照（即加入抗体染色，图2B），以评估未染色与染色细胞群的分离情况。初次使用AF488偶联抗体时，建议运行AF488偶联的同型对照，以评估染色特异性。若使用非偶联抗体，则可能需要额外设置对照，例如仅向细胞核样本中添加二抗，以评估二抗的非特异性结合。
3. 荧光激活细胞核分选（FANS）以排除神经元群体（耗时：45 分钟）
- 将免疫染色后的细胞核悬液转移至5 mL离心管中，并在进行流式细胞术操作前始终置于冰上。
注意：若处理的组织样本大于两个小鼠齿状回（DG），当悬液中细胞核密度过高时，可能需要使用WM缓冲液进一步稀释，以避免堵塞荧光激活细胞分选仪（FACS）。 - 在将样品管放入FACS仪器前，以低速涡旋振荡3秒（参见材料表）。
注意：（FACS设置）在实验开始前，需按照制造商的建议，使用校准微粒对分选仪器进行校准。根据所用FACS型号，使用微珠或微球（参见材料表）校准液滴延迟时间。样品在4 °C下以纯度模式进行分选。为减少收集体积，细胞核在流式细胞仪推荐压力下通过70 µm喷嘴进行分选。细胞核被分选至含有50 µL WM的1.5 mL低吸附离心管（参见材料表）中。所有收集管均在4 °C下用PBS + 5%牛血清白蛋白（BSA）包被过夜，以降低细胞核粘附管壁的风险。 - 为获取染色后细胞核悬液的检测数据，需在DAPI-高度（height）与DAPI-面积（area）图中设置门控，以排除细胞碎片及聚集的细胞核（图3A）。此外，通过在对数侧向散射（SSC）-面积与对数前向散射（FSC）-面积图中设置门控，进一步将单个细胞核与残留的DAPI染色聚集体或细胞碎片区分开（图3B）。
- 在anti-NeuN-AF488与FSC-面积图中设置门控，以分离NeuN-AF488阴性细胞群，如图3C所示。
- 分析完成后，根据上述门控策略，将NeuN-AF488阴性细胞群分选至装有50 µL WM的1.5 mL收集管中。
注意：按照上述门控策略及从小鼠成年脑中分离DG的解剖步骤，预期NeuN-AF488阴性细胞群约占单个细胞核总数的~14%。
表1：本研究中使用的培养基和缓冲液的组成。
| 细胞核分离缓冲液 #1 (NIM1) — 可在 4 °C 下保存长达 6 个月 | ||
| 组分 | 体积 (µL) | 终浓度 (mM) |
| 1.5 M 蔗糖 | 1,833.30 | 250 |
| 1 M KCl | 275 | 25 |
| 1 M MgCl2 | 55 | 5 |
| 1 M Tris 缓冲液，pH 8.0 | 110 | 10 |
| 无核酸酶水 | 8,726.70 | - |
| 总体积 | 11,000 | - |
| 细胞核分离缓冲液 #2 (NIM2) — 现配现用 | ||
| 组分 | 体积 (µL) | 终浓度 |
| NIM1 | 10,769 | - |
| 1 mM DTT | 11 | 1 µM |
| 100x 蛋白酶抑制剂 | 110 | 1x |
| 10% (v/v) Triton X-100 | 110 | 0.1% (v/v) |
| 总体积 | 11,000 | - |
| 匀浆缓冲液 (HB) — 现配现用 | ||
| 组分 | 体积 (µL) | 终浓度 |
| NIM2 | 10,958.75 | - |
| RNase 抑制剂，40 U µL-1 | 27.5 | 100 U mL-1 |
| RNasin，40 U µL-1 | 13.75 | 50 U mL-1 |
| 总体积 | 11,000 | - |
| 洗涤液 (WM) | ||
| 组分 | 体积 (µL) | 终浓度 |
| 7.5% BSA | 1,466.70 | 1% |
| RNase 抑制剂，40 U µL-1 | 27.5 | 100 U mL-1 |
| RNasin，40 U µL-1 | 13.75 | 50 U mL-1 |
| PBS | 9,492.05 | - |
| 总体积 | 11,000 | - |
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结果
图1：从小鼠成年齿状回（DG）组织制备单核悬液，用于非神经元细胞群体的单核RNA测序（snRNA-seq）。 流程图展示了本实验方案的主要步骤，包括小鼠齿状回的解剖、单核悬液的制备、NeuN免疫染色，以及在进行单核RNA测序（snRNA-seq）前对NeuN阴性细胞进行荧光激活核分选（FANS）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 ml 微量离心管 | Eppendorf | 30124537 | |
| 10.00µm Flouresbrite YG 羧基微球 | Polysciences | 15700-10 | |
| 15 mL聚丙烯离心管 | 康宁 | 430052 | |
| 2 把无菌杜蒙特 #5 镊子 | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 4′6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Sigma Aldrich | D9564-10MG | |
| 4150 TapeStation 系统 | 安捷伦 | N/A | |
| 5 mL 圆底高透明度聚丙烯试管，带 snap 盖 | Falcon | 352063 | |
| 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞滤网 snap 盖 | Falcon | 352235 | |
| 50 mL 聚丙烯离心管 | 康宁 | 430829 | |
| 70 µm细胞滤筛 | Falcon | 352350 | |
| 8 峰 SPHERO Rainbow 校准微粒 | BD 生物科学 | RCP-30-5A | |
| Accudrop 微珠 | BD 生物科学 | N/A | |
| Allegra X-30R 离心机 | 贝克曼库尔特 | N/A | |
| 抗 NeuN 抗体，克隆株 A60，Alexa Fluor 488 标记 | Millipore | MAB377X | |
| BD FACSAria Fusion 流式细胞仪 | BD 生物科学 | N/A | |
| Beckman Coulter MoFlo XDP | 贝克曼库尔特 | N/A | |
| BSA 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | 赛默飞世尔科技 | R0861 | |
| 邓氏组织研磨器套装：研钵、松配合杵（A）和紧配合杵（B） | KIMBLE | D8938-1SET | |
| Eppendorf管 Protein LoBind 1.5 ml | Eppendorf | 30108116 | |
| 停止，100倍蛋白酶抑制剂 | ThermoFisher | 78429 | |
| KCl | 任何化学品供应商 | 实验室自制 | |
| LUNA-FX7 自动细胞计数仪 | Logos Biosystems | N/A | |
| MgCl₂2 | 任何化学品供应商 | 实验室制备 | |
| N°10 把带保护装置的一次性无菌手术刀 | Swann-Morton | 6601 | |
| 无核酸酶水 | Sigma Aldrich | W4502-1L | |
| 无菌学生手术剪一对 | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| PBS | 任何化学品供应商 | 实验室自制 | |
| RNase 抑制剂 40 U µl-1 | Ambion | AM2684 | |
| RNasin 40 U µl-1 | Promega | N211A | |
| 无菌培养皿 | 康宁 | 430167 | |
| 蔗糖 | Sigma Aldrich | 59378-500G | |
| Tris缓冲液，pH 8.0 | 任何化学品供应商 | 实验室自制 | |
| Triton X-100 10% (v/v) | Sigma Aldrich | T8787-250ML | |
| 台盼蓝 | Invitrogen | T10282 |
