线虫生殖细胞命运重编程为神经元

摘要

来源：Kolundzic, E., 等 应用RNAi与热激诱导的转录因子表达将生殖细胞重编程为神经元 秀丽隐杆线虫. J. Vis. Exp. (2018).

本视频展示了线虫生殖细胞向神经元的细胞命运重编程。通过RNA干扰（RNAi）处理转基因线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的幼虫，敲低一种特定的染色质调控因子，使其后代的生殖细胞更易于发生细胞命运重编程。对后代施加热激处理，诱导其生殖细胞表达一种神经元特异性的转录因子，从而触发其转化为神经元，并利用荧光报告基因的表达进行鉴定。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 溶液配制

1. NGM-琼脂平板（1 L）
   1. 加入 3 g NaCl、2.5 g 胰蛋白胨培养基（例如 Bacto-Peptone）和 20 g 琼脂。高压灭菌后，加入 1 mL 胆固醇（5 mg/mL 溶于 95% 乙醇 [EtOH] 的储备液）、1 mL 1 M MgSO₄、1 mL 1 M CaCl₂、25 mL 1 M K₂PO₄ 和 1 mL 两性霉素 B（2.5 mg/mL 储备液）。
2. NGM-琼脂 RNAi 平板（1 L）
   1. 加入 3 g NaCl、2.5 g 胰蛋白胨培养基和 20 g 琼脂。高压灭菌后，加入 1 mL 胆固醇（5 mg/mL 溶于 95% EtOH 的储备液）、1 mL 1 M MgSO₄、1 mL 1 M CaCl₂、25 mL 1 M K₂PO₄、1 mL 两性霉素 B（2.5 mg/mL 储备液）、1 mL 1 M 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和 1 mL 羧苄青霉素（50 mg/mL）。
3. LB（Luria-Bertani）-琼脂（1 L）
   1. 加入 10 g 胰蛋白胨培养基、5 g 酵母提取物、5 g NaCl、20 g 琼脂和 10 mL 1 M Tris（pH 8.0）。加 H₂O 至 1 L。高压灭菌后，加入 1 mL 50 mg/mL 羧苄青霉素和 2.5 mL 5 mg/mL 四环素。
4. LB 培养基（1 L）
   1. 加入 10 g 胰蛋白胨培养基、5 g 酵母提取物、5 g NaCl 和 10 mL 1 M Tris（pH 8.0）。加 H₂O 至 1 L。高压灭菌后，加入 1 mL 50 mg/mL 羧苄青霉素。
5. M9 缓冲液（1 L）
   1. 加入 6.0 g Na₂HPO₄、3 g K₂PO₄、5 g NaCl 和 50 mg 明胶。使用前加入 1 mL 1 M MgSO₄。
6. 漂白液（10 mL）
   1. 加入 1 mL NaClO 和 2 mL 5 N NaOH。加 H₂O 至 10 mL。

2. RNAi 平板的制备

注意：C. elegans 通常在含有 7.5 mL 线虫生长培养基琼脂（NGM-琼脂）的 6 cm 培养皿中于实验室培养。本实验方案适用于在 15 °C 条件下培养的线虫。制备 NGM 培养皿时，应采用标准无菌操作技术，以防止真菌和细菌污染。以下是制备添加了 RNAi 试剂的 NGM 培养皿的实验步骤。

1. 准备含有 1 mM IPTG 和 50 µg/mL 羧苄青霉素的 6 cm NGM-琼脂 RNAi 平板。在室温避光条件下干燥 24 – 48 小时。
   1. 将 RNAi 平板置于 4 °C 避光保存。若超过 14 天则不得使用。
2. 从现有的 RNAi 文库¹³ 中，使用三区划线法，在含有 50 µg/mL 羧苄青霉素和 12.5 µg/mL 四环素的 LB-琼脂平板上，挑选含有插入 lin-53 基因 DNA 序列的 L4440 质粒的 RNAi 细菌克隆（Escherichia coli HT115）。于 37 °C 过夜培养。该克隆可在 IPTG 诱导下在细菌中表达 lin-53 双链 RNA（dsRNA）。
   1. 同时，培养含有无插入基因序列的 L4440 空载体质粒的 RNAi 细菌作为阴性对照。
3. 次日，使用 200 µL 移液器吸头从 lin-53 或空载体的 LB-琼脂平板上挑取单菌落，分别接种至含有 2 mL 添加 50 µg/mL 羧苄青霉素的液体 LB 培养基的独立培养管中。于 37 °C 过夜培养，直至菌液在 600 nm 处的光密度（OD）达到 0.6 – 0.8。使用分光光度计测定 OD 值。
   ​注意：与从甘油保存菌种划线所用的 LB-琼脂平板不同，液体 LB 培养基中不应添加四环素，因为在喂养阶段加入四环素会降低 RNAi 效率。
4. 使用多通道移液器将每种细菌培养物（lin-53 或空载体）各取 500 µL 加入 6 cm NGM-琼脂 RNAi 平板中。平板加盖后于室温避光孵育过夜，使其干燥。在此期间，NGM 平板中的 IPTG 将诱导细菌产生 dsRNA。
   1. 每次实验每种细菌培养物至少使用 3 个平板，以提供 3 个技术重复。
5. 将接种细菌并干燥后的 NGM-琼脂 RNAi 平板置于 4 °C 避光保存，最多可保存两周。

3. 准备 秀丽隐杆线虫 菌株 BAT28

1. 维持含有转基因的线虫品系 BAT288 otIs305 [hsp-16.2启动子::che-1, rol-6(su1006)] 和 ntIs1 [gcy-5prom::gfp在15 °C条件下，使用标准NGM琼脂平板培养OP50细菌。
   注意： 有关线虫培养的详细方案，请参见。 rol-6(su1006) 是一种显性等位基因，常作为表型注射标记物16，可导致典型的翻滚运动。该基因被用于 otIs305 转基因追踪 hsp-16.2启动子::che-1.
   1. 始终将 BAT28 菌株保存在 15 °C，以防止其过早活化 hsp-16.2启动子::che-1 转基因。在操作该品系时，应尽可能减少暴露于高于15 °C的温度环境。
2. 为实现线虫的年龄同步，采用氯解技术。
   1. 用 900 µL M9 缓冲液冲洗含有 BAT28 成虫和卵的 6 cm NGM 琼脂平板。以 900 x g 1 分钟。去除上清液。
   2. 加入 0.5–1 mL 漂白液，振荡试管约 1 分钟，直至成虫线虫开始破裂。使用标准体视显微镜进行观察。
   3. 以900 x g离心沉淀线虫 g 离心1分钟，弃去上清液。
   4. 用800 µL M9缓冲液重悬虫体沉淀，900 x g离心，重复洗涤3次 g.
   5. 将清洗后的卵放置于接种了OP50细菌的新鲜NGM平板上。在15 °C条件下，将经过漂白处理的线虫种群在OP50细菌上培养至L4期（约4天）。使用标准体视显微镜，可通过观察线虫腹侧约中点处的白色斑块来识别L4期幼虫18。
      注意： 在耗尽条件下实现生殖细胞向神经元转化的表型 lin-53，需要在亲代（P0）中将其耗尽。表型转换的评分在下一代（子代F1）中进行。为实现耗尽 lin-53 在P0代，L4期动物即接受RNAi处理。
3. 手动使用铂金丝将50条L4期线虫转移至不含任何细菌的NGM平板上，每组重复操作一次，使线虫远离任何被转移的OP50细菌。让线虫在平板上移动约5分钟。使用先前接种于NGM-琼脂RNAi平板上的细菌 lin-53 将RNAi细菌（或空载体对照）转移至相应的RNAi平板。
   1. 避免将OP50菌株转移至实际的RNAi平板上。操作需迅速，以尽量减少菌株暴露于高于15 °C温度环境的时间。
4. 在15 °C下将线虫孵育于NGM-琼脂RNAi平板上约7天，直至线虫的F1代子代发育至L3–L4阶段。此时F1代个体可明显与P0代成虫区分开，因其体型更大、更粗壮。​
   1. 在体视显微镜下目视检查F1代子代线虫是否表现出外突的阴门（pvul）表型，如图所示 图1. 针对的RNAi lin-53 具有多效性作用并导致 pvul 表型，可用于评估针对RNAi的干预效果 lin-53 已取得成功。
      注意： RNAi 靶向 lin-53 也可能导致F1代胚胎死亡。若在动物发育至L3–L4阶段前将培养板暴露于高于15 °C的环境中，该效应会增强。死亡胚胎表现为发育停滞且无法孵化。
   2. 在避光条件下孵育平板，因为IPTG对光敏感。

4. 诱导生殖细胞重编程

1. 将含有经 lin-53 和空载体 RNAi 处理的 F1 后代的 RNAi 培养板在避光条件下于 37 °C 孵育 30 分钟，以激活 CHE-1。使用带通风功能的培养箱，因其可实现更高效的热激。
2. 将热激后的线虫在室温避光条件下恢复 30 分钟，随后将培养板在 25 °C 避光过夜孵育。
3. 使用配备荧光光源的常规体视显微镜，在绿色荧光蛋白（GFP）滤光片下观察线虫中体区域由 gcy-5prom::gfp 驱动的荧光信号，如图 2所示。显微镜 GFP 信号设置：激发光最大波长为 488 nm，发射光最大波长为 509 nm。
4. 通过将中体区域具有 GFP 信号的线虫置于含琼脂垫的显微载玻片上，评估生殖细胞向神经元转化的程度。​
   1. 统计显示生殖细胞向神经元转化的个体数量与无荧光信号个体数量，以评估表型外显率。通常，在 lin-53 缺失条件下约有 30% 的个体在生殖系中表现出明确的 GFP 信号，而在空载体 RNAi 条件下，仅有不超过 5% 的个体在生殖系中表现出弥散性 GFP 信号。

结果

图1： pvu由针对 lin-53 的 RNAi 引起的 l 表型。 （顶部）明场微分干涉对比（DIC）图像，显示来自对照组或 lin-53 经RNAi处理的母体。比例尺 = 20 µm。（底部）经处理的动物 lin-53 RNAi 显示出突出的阴门（Pvl）表型pvul）表型（黑色箭头）。 pvul 表型证实了针对RNAi的 lin-53 成功。比例尺 = 20 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学试剂
琼脂（Agar-Agar, Kobe I）	Roth	5210.1
蛋白胨（Bactopeptone）	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
酵母提取物（Yeast extract）	AppliChem	A1552,0100
两性霉素B（Amphotericin B）	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
胆固醇（Cholesterol）	Roth	8866.2
明胶（Gelatine）	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	2,51,63,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
羧苄青霉素（Carbenicillin）	Roth	634412
四环素（Tetracycline）	Roth	2371.2
培养箱
培养箱	New Brunswick Scientific C24	M1247-0052	用于热激
培养箱	Sanyo MIR-5	5534210	用于在 15 °C 或 25 °C 下维持线虫品系
显微镜
荧光显微镜	M205 FA	Leica
显微镜（成像）+ 相机	Axio Imager 2	Zeiss
显微镜（成像）+ 相机	Sensicam	PCO
体视显微镜	SMZ745	Nikon
细菌菌株
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 裂原：lavUV5 启动子 -T7 RNA 聚合酶)（IPTG 可诱导 T7 聚合酶）（RNAse III 缺陷型）。
Escherichia coli OP50			尿嘧啶营养缺陷型大肠杆菌菌株
线虫品系
BAT28：otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			由 OH9846 经与 N2 回交四次以上获得
RNAi 克隆
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer 文库 16B07 染色体I, K07A1.12
空载体：L4440	Addgene	#1654
其他
线虫挑取针			使用巴斯德移液管和铂丝自制