线虫生殖细胞命运重编程为神经元

摘要

来源：Kolundzic, E., 等 应用RNAi与热激诱导的转录因子表达将生殖细胞重编程为神经元 秀丽隐杆线虫. J. Vis. Exp. (2018).

本视频展示了线虫生殖细胞向神经元的细胞命运重编程。通过RNA干扰（RNAi）处理转基因线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的幼虫，敲低一种特定的染色质调控因子，使其后代的生殖细胞更易于发生细胞命运重编程。对后代施加热激处理，诱导其生殖细胞表达一种神经元特异性的转录因子，从而触发其转化为神经元，并利用荧光报告基因的表达进行鉴定。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 溶液配制

1. NGM-琼脂平板（1 L）
   1. 加入 3 g NaCl、2.5 g 胰蛋白胨培养基（例如 Bacto-Peptone）和 20 g 琼脂。高压灭菌后，加入 1 mL 胆固醇（5 mg/mL 溶于 95% 乙醇 [EtOH] 的储备液）、1 mL 1 M MgSO₄、1 mL 1 M CaCl₂、25 mL 1 M K₂PO₄ 和 1 mL 两性霉素 B（2.5 mg/mL 储备液）。
2. NGM-琼脂 RNAi 平板（1 L）
   1. 加入 3 g NaCl、2.5 g 胰蛋白胨培养基和 20 g 琼脂。高压灭菌后，加入 1 mL 胆固醇（5 mg/mL 溶于 95% EtOH 的储备液）、1 mL 1 M MgSO₄、1 mL 1 M CaCl₂、25 mL 1 M K₂PO₄、1 mL 两性霉素 B（2.5 mg/mL 储备液）、1 mL 1 M 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和 1 m....

结果

图1： pvu由针对 lin-53 的 RNAi 引起的 l 表型。 （顶部）明场微分干涉对比（DIC）图像，显示来自对照组或 lin-53 经RNAi处理的母体。比例尺 = 20 µm。（底部）经处理的动物 lin-53 RNAi 显示出突出的阴门（Pvl）表型pvul）表型（黑色箭头）。 pvul 表型证实了针对RNAi的 lin-53 成功。比例尺 = 20 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学试剂
琼脂（Agar-Agar, Kobe I）	Roth	5210.1
蛋白胨（Bactopeptone）	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
酵母提取物（Yeast extract）	AppliChem	A1552,0100
两性霉素B（Amphotericin B）	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
胆固醇（Cholesterol）	Roth	8866.2
明胶（Gelatine）	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	2,51,63,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
羧苄青霉素（Carbenicillin）	Roth	634412
四环素（Tetracycline）	Roth	2371.2
培养箱
培养箱	New Brunswick Scientific C24	M1247-0052	用于热激
培养箱	Sanyo MIR-5	5534210	用于在 15 °C 或 25 °C 下维持线虫品系
显微镜
荧光显微镜	M205 FA	Leica
显微镜（成像）+ 相机	Axio Imager 2	Zeiss
显微镜（成像）+ 相机	Sensicam	PCO
体视显微镜	SMZ745	Nikon
细菌菌株
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 裂原：lavUV5 启动子 -T7 RNA 聚合酶)（IPTG 可诱导 T7 聚合酶）（RNAse III 缺陷型）。
Escherichia coli OP50			尿嘧啶营养缺陷型大肠杆菌菌株
线虫品系
BAT28：otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			由 OH9846 经与 N2 回交四次以上获得
RNAi 克隆
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer 文库 16B07 染色体I, K07A1.12
空载体：L4440	Addgene	#1654
其他
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