通过机械均质化从小鼠大脑中分离多种细胞类型

Abstract

来源:Molina Estevez， F. J.， et al. 通过不同均质化方法从小鼠脑/脊髓中检索的多种细胞类型的同时流式细胞术表征。 （2019 年）。

该视频演示了从小鼠脑组织中分离多种类型的细胞。首先使用组织研磨机在盐溶液中对组织进行机械剪切，以保持渗透平衡。然后将组织匀浆进行密度梯度离心以去除细胞碎片。然后将细胞重悬于溶液中以进行进一步分析。

Protocol

>免责声明:所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 大脑和脊髓的机械均质化

注意:本节中描述的体积足以对二分之一的大脑或脊髓进行均质化。

将
1. Dounce 组织研磨机（材料表）的玻璃砂浆置于冰上预冷。
2. 向研钵中加入 3 mL 预冷的 1x Hank 平衡盐溶液 （HBSS）。
3. 将组织（脑或脊髓）从 6 孔板的孔中转移到玻璃砂浆中，确保将其浸入 1x HBSS 中并位于砂浆底部。
4. 用杵 A 轻轻捣碎 10 次，然后用杵 B 轻轻捣碎 10 次。将匀浆混合物转移到新的 15 mL 锥形管中。
5. 使用预冷的 1x HBSS 将试管填充至最终体积为 10 mL，并在 4 °C 下以 320 x g 离心 10 分钟。
6. 吸出上清液，向每个试管中加入冰冷的 1x HBSS，最终体积为 7 mL，然后通过涡旋轻轻重悬沉淀。

2. 清除碎片

注意:去除主要由未消化的组织和髓鞘组成的碎片是允许组织匀浆有效染色以进行后续流式细胞术分析的关键步骤。

1. 通过 70 μm 细胞过滤器过滤每个样品，以去除任何未消化的组织块。在处理脊髓组织时，此步骤尤为重要，因为这些样品更可能包含可能影响后续步骤的未消化神经碎片或脑膜。
2. 确保每个样品管中的最终体积为 7 mL。如果没有，请填充冰冷的 1x HBSS 至 7 mL。
3. 向每个样品中加入 3 mL 预冷等渗 Percoll 溶液 （IPS），使最终体积为 10 mL 的溶液中含有最终浓度为 30% 的密度梯度培养基。轻轻涡旋样品以确保它们均匀混合。
4. 在 18 °C 下以 700 x g 离心样品 15 分钟，确保将离心机的加速度设置为 7，将制动器设置为 0.
   注意: 离心大约需要 30 分钟。
5. 小心地从离心机中取出样品。
   注意:应该可以看到由碎片和髓鞘组成的白色圆盘漂浮在溶液表面。在试管底部应可见沉淀（包含感兴趣的细胞）。
6. 小心吸出所有白色的碎屑盘，然后吸出其余的上清液，确保颗粒不会脱落。在细胞沉淀顶部留下约 100 μL 溶液，以避免无意中移动的风险。
7. 加入 1 mL 流式细胞术 （FACS） 封闭 （BL） 溶液，用 1000 μL 移液器吸头上下吹打重悬沉淀，然后将样品转移至 1.5 mL 试管中。
8. 在室温 （RT） 下以 450 x g 离心 5 分钟。
9. 轻轻吸出上清液，并将沉淀重悬于与下游分析兼容的适当缓冲液中

Materials