通过机械匀浆法从小鼠脑中分离多种细胞类型

摘要

来源：Molina Estevez, F. J.，等。通过不同匀浆方法从小鼠脑/脊髓中分离多种细胞类型的流式细胞术同步表征。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了从小鼠脑组织中分离多种类型细胞的方法。首先，在盐溶液中使用组织研磨器对组织进行机械剪切，以维持渗透压平衡。随后，将组织匀浆液进行密度梯度离心，以去除细胞碎片。最后，将细胞重新悬浮于溶液中，用于后续分析。

方案

免责声明： 所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

1. 脑和脊髓的机械匀浆

注意：本节所述体积适用于半只脑或脊髓的匀浆处理。

1. 将Dounce组织研磨器的玻璃研钵（材料表）置于冰上预冷。
2. 向研钵中加入3 mL预冷的1×Hank's平衡盐溶液（HBSS）。
3. 将组织（脑或脊髓）从6孔板的孔中转移至玻璃研钵中，确保其浸入1×HBSS并沉于研钵底部。
4. 先用研杵A轻轻研磨10次，再用研杵B研磨10次。将匀浆后的混合液转移至新的15 mL锥形离心管中。
5. 用预冷的1×HBSS补加液体至终体积10 mL，在4 °C下以320 × g离心10分钟。
6. 吸除上清液，向每管中加入冰冷的1×HBSS至终体积7 mL，并通过涡旋轻轻重悬沉淀。

2. 去除碎片

注意：去除主要由未消化组织和髓鞘组成的碎片是关键步骤，可确保组织匀浆在后续流式细胞术分析中实现高效染色。

1. 将每个样品通过70 µm细胞滤筛过滤，以去除未消化的组织块。此步骤在处理脊髓组织时尤为重要，因为此类样品更可能含有未消化的神经碎片或脑膜，可能影响后续操作。
2. 确保每个样品管中的终体积为7 mL。若不足，用预冷的1× HBSS补至7 mL。
3. 向每个样品中加入3 mL预冷的等渗Percoll溶液（IPS），使终体积为10 mL，其中密度梯度介质的终浓度为30%。轻轻涡旋混匀样品，确保均匀混合。
4. 在18 °C下以700 × g离心15分钟，离心时确保加速度设为7，刹车设为0。
   注意：离心过程总时长应约为30分钟。
5. 小心地从离心机中取出样品。
   注意：应可见一层由碎片和髓鞘组成的白色盘状物漂浮在溶液表面，管底可见细胞沉淀（含目标细胞）。
6. 小心吸除全部白色碎片层及上清液，注意勿扰动沉淀。在细胞沉淀上方保留约100 µL溶液，以避免意外吸出沉淀。
7. 加入1 mL流式细胞术（FACS）封闭（BL）溶液，用1000 µL移液枪头反复吹打重悬沉淀，并将样品转移至1.5 mL离心管中。
8. 室温（RT）下以450 × g离心5分钟。
9. 轻轻吸除上清液，并将沉淀重悬于适合后续分析的适当缓冲液中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10X HBSS（不含钙、氯化镁和硫酸镁）	Gibco	14185-052
70 mm 细胞筛	Corning	431751
锥形管（15 mL）	CellTreat	229411
锥形管（50 mL）	CellTreat	229422
杜恩斯组织研磨器套装（包含研钵以及A型和B型研杵）	Sigma-Aldrich	D9063-1SET
Percoll	GE Healthcare	10266569	以非无菌试剂形式出售
Percoll	Sigma	65455529	无菌试剂（用于需要无菌条件的应用）
Percoll PLUS	Sigma	GE17-5445-01	内毒素含量极低的试剂