从小鼠脉络丛中分离免疫细胞

摘要

来源：Dominguez-Belloso，等。从小鼠脉络丛显微解剖组织中分离与鉴定免疫细胞。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了从小鼠脉络丛中分离免疫细胞的操作步骤。该方法应用于神经免疫学研究，以探讨脉络丛中的免疫细胞如何影响大脑健康及多种神经系统疾病。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 材料的准备

1. 磁珠激活细胞分选（MACS）缓冲液：在PBS-/-中配制含2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和0.5%牛血清白蛋白（BSA）（材料表）的溶液。
2. IV型胶原酶储备液（20 U/μL）：将粉末溶于PBS+/+（材料表）中，分装后于-20 °C保存。
   注意： IV型胶原酶需要MgCl₂才能完全激活；避免对IV型胶原酶溶液进行冻融。
3. 麻醉镇痛溶液：在1 mL PBS-/-中混合150 μL氯胺酮（150 mg/kg）、25 μL赛拉嗪（5 mg/kg）和330 μL布托啡诺（0.1 mg/kg）。
   注意： 麻醉镇痛溶液需现用现配，保存时间不得超过一天。
4. 肝素溶液（100 U/mL）：将粉末溶于PBS-/-中。
5. 准备灌注插入系统，将一根导管连接至装有PBS-/-的锥形烧瓶。在灌注管末端连接一支23 G针头。打开灌注装置，使PBS流动直至导管内无气泡。
6. 准备配备光源的双目放大镜。

C57BL/6 小鼠的饲养

1. 分析脉络丛（choroid plexuses）的髓系细胞或T细胞时，每组使用四只小鼠，并将四只小鼠的脉络丛组织合并（每侧脑室、第三脑室和第四脑室的脉络丛各两个；总计八份样本）。若不合并脉络丛样本，可能因这些免疫细胞在脉络丛中数量稀少而无法检测到稀有的免疫细胞群体。
2. 实验前让小鼠至少适应环境7天。将小鼠饲养于恒温恒湿的无病原体环境中，光照周期为12小时光照/12小时黑暗或14小时光照/10小时黑暗，可自由获取水和标准颗粒饲料（ad libitum）。

3. ​PBS 灌注与脑组织解剖

1. 称量每只小鼠的体重，并按 10 μL/g 的剂量将麻醉-镇痛混合溶液（步骤 1.3）腹腔注射。
2. 等待约 30 分钟以确保充分镇痛（通过轻捏小鼠脚趾检查麻醉深度）。
3. 将麻醉后的小鼠仰卧位平放于解剖支撑台上，并用胶带固定其掌部。
4. 用镊子夹住动物皮肤，使用剪刀切开腹部、膈肌和胸腔，暴露心脏。
   注意：打开胸腔后，脑组织将迅速缺氧。必须准确且迅速地完成后续灌注操作。
5. 将 20 μL 的 100 U/mL 肝素溶液直接注入左心室。
6. 使用精细剪刀，在右心房处做至少 3 mm 的切口，以便血液流出体外。
7. 紧接着，将连接输液管末端的 23 G 针头插入左心室尖端。
8. 将输液系统调至最大流速，等待完成灌注：使用 23 G 针头、流速约为 6 mL/min 时，灌注过程在 3 分钟内完成。
   注意：肝脏等器官均匀褪色表明灌注有效。
9. 关闭输液系统，并将针头从心室中取出。
10. 移除小鼠掌部的胶带，将小鼠转为俯卧位。
11. 用镊子夹住动物皮肤，使用剪刀从眼睛至耳部区域去除头部顶部的皮肤。
12. 借助剪刀，首先在两眼之间剪开颅骨，然后从每只眼睛外侧沿至咬肌上方的脊髓处进行横向剪切。操作时应使用剪刀尖端，动作轻柔，避免剪刀损伤脑组织。
13. 用镊子从两眼之间的颅骨前端夹起并打开颅骨。
14. 使用剪刀切断脊髓，再用镊子夹住脑组织两侧，将其倾斜取出并置于盛有冰冻 PBS+/+ 的培养皿中。随后立即采集脉络丛（CPs）。
    注意：检查脑组织是否褪色，以确认灌注效果。

4. 从脑组织中分离脉络丛

1. 将脑组织背侧朝上置于培养皿中，并置于双目放大镜的物镜下方。
2. 用镊子固定脑组织，借助另一把镊子的两个尖端沿半球之间的中线插入。
3. 使用镊子将带有胼胝体和海马的皮层从隔区拉开，暴露侧脑室及部分第三脑室。
4. 辨认侧脑室脉络丛（lateral CP）：其为一条沿侧脑室分布、两端展开的长条状薄膜。用细镊子的两个尖端夹住侧脑室脉络丛。注意收集可能被海马后褶遮蔽的三角形后部区域。
5. 将对侧半球的皮层、胼胝体和海马从隔区拉开，以充分暴露整个第三脑室及对侧侧脑室。
6. 用精细镊子收集第三脑室脉络丛（third CP），其可识别为具有颗粒状表面的短小结构。
7. 收集另一侧的侧脑室脉络丛（lateral CP）。
8. 将镊子的两个尖端插入小脑与中脑之间，分离小脑与脑桥及延髓，以暴露第四脑室。
9. 辨认第四脑室脉络丛（fourth CP）：其为一条具有颗粒状表面的长条状球形结构，沿第四脑室分布，从小脑与延髓之间的右侧外侧端延伸至左侧端。使用精细镊子收集第四脑室脉络丛。
   注意： 使用硅烷涂层镊子可防止脉络丛黏附于镊子表面。
10. 对其余七只小鼠重复步骤 3.1–4.9。在此期间，已收集的脉络丛可暂时保存于置于冰上的离心管中。

5. 流式细胞术分析样品的制备

1. 用 PBS+/+ 将含有所有分离的脉络丛（CP）的离心管补至 750 μL。
   注意： 使用细镊子将分离的脉络丛（CP）放入离心管时会残留少量 PBS+/+。为避免可能的CP组织损失，建议将现有液体体积补足至750 μL，而不是弃去后更换750 μL新鲜的PBS+/+。
2. 加入15 μL 20 U/μL的IV型胶原酶原液（参见步骤1.2），使终浓度为400 U/mL。
   注意： 可添加DNAse I（150 μg/mL）以防止细胞过度聚集。
3. 将脉络丛（CP）在37 °C、轻度振荡（300 RPM）条件下与IV型胶原酶共同孵育45分钟。
4. 轻轻吹打约10次，以完成脉络丛（CP）的解离。
5. 用MACS缓冲液（参见配方步骤1.1）将CP离心管补至1.5 mL，以终止IV型胶原酶活性。
   注意： IV型胶原酶活性在低温下停止，并可被血清白蛋白抑制。
6. 在4 °C下以500 × g 离心5分钟，弃去上清液，并用1.5 mL MACS缓冲液重悬细胞进行洗涤。
7. 在4 °C下再次以500 × g 离心5分钟，弃去上清液，将细胞重悬于220 μL MACS缓冲液中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗小鼠 CD16/CD32	BD Biosciences	553142	流式细胞术抗体
牛血清白蛋白	MP Biomedicals	160069	封闭试剂
APC 标记抗小鼠 CX3CR1	BioLegend	149008	流式细胞术抗体
APC 标记抗小鼠 TCRb	BioLegend	109212	流式细胞术抗体
APC-Cy7 标记抗小鼠 CD4	BioLegend	100414	流式细胞术抗体
APC-Cy7 标记抗小鼠 IA-IE	BioLegend	107628	流式细胞术抗体
BD FACSymphony A5 细胞分析仪	BD Biosciences		流式细胞仪分析仪
BV711 标记抗小鼠 Ly6C	BioLegend	128037	流式细胞术抗体
胶原酶 IV	Gibco	17104-019	用于解离 CP 组织的酶
DAPI	Thermo Scientific	62248	活/死细胞标记物
EDTA			离子螯合剂
精细剪刀	FST	14058-11	解剖工具
FITC 标记抗小鼠 CD45	BioLegend	103108	流式细胞术抗体
流量控制器灌注插件	CareFusion	RG-3-C	血液灌注插件
FlowJo 软件	BD Biosciences		分析软件
镊子	FST	11018-12	解剖工具
肝素	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	抗凝剂
Imalgene	Boehringer Ingelheim		氯胺酮，麻醉剂
OneComp eBeads	Invitrogen	01-1111-42	用于实现补偿的对照微珠
PBS-/-	Gibco	14190-094	缓冲液
PBS+/+	Gibco	14040-091	缓冲液
PE 标记抗小鼠 CD8a	BioLegend	100708	流式细胞术抗体
PE 标记抗小鼠 F4/80	BioLegend	123110	流式细胞术抗体
PE-Dazzle 594 标记抗小鼠 CD11b	BioLegend	101256	流式细胞术抗体
Rompun	Bayer		赛拉嗪，麻醉剂
细镊	Dumoxel Biology	11242-40	解剖工具
Vetergesic	Ceva		丁丙诺啡，镇痛剂