从小鼠脉络丛中分离免疫细胞

摘要

来源:Dominguez-Belloso 等人。显微解剖小鼠脉络丛免疫细胞的分离和表征。J. Vis. Exp.（2022 年）

该视频演示了从小鼠脉络丛中分离免疫细胞的过程。该程序用于神经免疫学研究，以了解脉络丛中的免疫细胞如何影响大脑健康和各种神经系统疾病。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 材料的准备

1. 磁激活细胞分选 （MACS） 缓冲液:在 PBS-/- 中制备 2 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 和 0.5% 牛血清白蛋白 （BSA）（材料表）。
2. 胶原酶 IV 储备溶液 （20 U/μL）:将粉末重悬于 PBS+/+（材料表）中，分装，并储存在 -20 °C.
   注意:胶原酶 IV 需要 MgCl2 完全活跃;不要冻融胶原酶 IV 溶液。
3. 麻醉镇痛溶液:将 150 μL 氯胺酮 （150 mg/kg）、25 μl 甲苯噻嗪 （5 mg/kg） 和 330 μl buprecare （0.1 mg/kg） 混合在 1 mL PBS-/-.
   中 注意:临时准备麻醉镇痛溶液，保存时间不要超过一天。
4. 肝素溶液 （100 U/mL）:将粉末重悬于 PBS-/- 中。
5. 准备将管子连接到装满 PBS-/- 的卧螺离心机锥形机的输液插入系统。将 23 G 针头连接到输液管的末端。打开输液插入物，让 PBS 运行，直到试管中没有气泡。
6. 准备装有灯的双目放大镜。

2. C57BL/6 小鼠的外壳

1. 为了分析 CP （脉络丛） 髓系细胞或 T 细胞，每只小鼠使用四只小鼠，并汇集四只 CP（来自每个侧脑室、第三脑室和第四脑室 CP 的两只;总共八只小鼠）。由于它们的丰度低，不汇集 CP 存在无法检测到 CP 中罕见免疫种群的风险。
2. 在进行任何实验之前，让小鼠适应环境至少 7 天。将小鼠置于无病原体的条件下，在恒定的温度和湿度下，在 12/12 小时或 14/10 小时的光照/黑暗循环中，随意用水和标准颗粒食物。

3. PBS 灌注和脑解剖

1. 给每只小鼠称重，腹膜内注射 10 μL/g 麻醉 - 镇痛混合溶液（步骤 1.3）。
2. 等待约 30 分钟以获得有效的镇痛（通过捏住鼠标的手指检查麻醉深度）。
3. 将麻醉的鼠标平躺在解剖支架上，并将其手掌贴在解剖支架上。
4. 用镊子和剪刀捏住动物的皮肤，打开腹部、横膈膜和胸部，露出心脏。
   注意:当胸腔打开时，大脑会变得缺氧。必须准确、迅速地进行灌注的后续步骤。
5. 将 20 μL 100 U/mL 肝素溶液直接注入左心室。
6. 用细剪刀在右心房切开至少 3 毫米的切口，让血液流出体外。
7. 紧接着，将放置在输液管末端的 23 G 针头穿过左心室尖端。
以
8. 最大速度打开输注系统并等待完全灌注:使用 23 G 针头以约 6 mL/min 的流速，在 3 分钟内完成><灌注。 注意:肝脏等器官的均匀变色证明了灌注功效。
9. 关闭输液系统并从心室中取出针头。
10. 撕下鼠标手掌上的胶带。将鼠标置于腹侧位置。
11. 用镊子和剪刀捏住动物的皮肤，从头顶到眼睛到耳朵去除皮肤。
12. 在剪刀的帮助下，先在眼睛之间切开头骨，然后从每只眼睛横向切开到咬肌上方的脊髓。为此，请使用剪刀的末端并轻轻作，以避免剪刀损坏大脑。
13. 用镊子从眼睛之间的末端捏住头骨，打开头骨。
14. 用剪刀剪断脊髓，用镊子取出大脑，将它们的两个点放在大脑的外侧使其倾斜，并将其放入装满冰冷 PBS + / + 的培养皿中。然后立即收集 CP。
    注意:检查大脑是否变色以验证灌注效果。

4. 从大脑中解剖脉络丛

1. 将大脑背侧向上放置在培养皿中，并位于双眼放大镜的目标下方。
2. 在镊子的帮助下将大脑保持在原位，将另一个镊子的两端向下插入半球之间的中线。
3. 使用镊子将带有胼胝体和海马体的皮质从隔膜中拉出，露出侧脑室和第三脑室的一部分。
4. 将外侧 CP 识别为侧脑室内衬的一层长纱，两端均呈张开。使用细镊子的两端捕捉外侧 CP。小心收集可能被海马后褶皱隐藏的三角形后部。
5. 将对侧半球的皮层、胼胝体和海马体从隔膜上拉开，露出整个第三脑室和对侧侧脑室。
6. 用细镊子收集第三个 CP，它可以被识别为具有颗粒表面的短结构。
7. 收集另一个外侧 CP。
8. 将镊子的两端向下插入小脑和中脑之间。将小脑与脑桥和延髓分离，露出第四脑室。
9. 将第四 CP 识别为具有颗粒状表面的长球状结构，从小脑和延髓之间的右外侧到左端排列在第四脑室中。用细镊子收集第四个 CP.
   注意:镊子的硅烷基涂层可以防止 CP 在镊子上发粘。
10. 对其他 7 只小鼠中的每只重复步骤 3.1-4.9。同时，收集的 CP 可以暂时保存在放置在冰上的试管中。

5. 制备用于流式细胞术分析的样品

1. 将装有所有解剖 CP 的试管填充到 750 μL PBS + /+ .
   注意:用细镊子在管中沉积解剖的 CP 会产生少量的 PBS+/+。为避免 CP 组织可能造成的损失，最好将现有体积完成至 750 μL，而不是取出并用新鲜的 750 μL PBS+/+ 替换。
2. 加入 15 μL 的 20 U/μL 胶原酶 IV 储备溶液（参见步骤 1.2），最终浓度为 400 U/mL.
   注意:DNAse I （150 μg/mL） 可以防止细胞过度聚集。
3. 将 CP 与胶原酶 IV 在 37 °C 下在轻度搅拌 （300 RPM） 下孵育 45 分钟。
4. 轻轻上下移液约 10 次以完成 CP 解离。
5. 用 MACS 缓冲液将 CP 管填充至 1.5 mL（参见配方步骤 1.1）以终止胶原酶 IV 活性><。 注意:胶原酶 IV 活性在低温下终止并被血清白蛋白抑制。
6. 在 4 °C 下以 500 x g 离心细胞 5 分钟。弃去上清液，用 1.5 mL MACS 缓冲液洗涤细胞。
7. 在 4 °C 下以 500 x g 离心细胞 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 220 μL MACS 缓冲液中。

材料