从新生小鼠脑组织中获取混合胶质细胞培养物

摘要

来源：Sarkar, S. 等，快速且优化的CD11b磁珠分离法用于高纯度和多功能性的原代小胶质细胞提取。视觉化实验杂志 (2017)

该视频展示了从新生小鼠脑组织中分离和培养细胞的方法。该方法包括对脑组织进行酶消化和机械解离，随后在不含神经元生长因子的培养基中进行培养，以获得混合的胶质细胞群体。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 混合胶质细胞培养物的培养

1. 使用5.5英寸手术剪迅速将出生1-2天的幼鼠断头，并立即将头部放入盛有冰的50 mL离心管中。请注意，此断头操作即为安乐死方法。
2. 在超净工作台内，使用4.5英寸直头显微解剖剪在颅骨和脑膜上做一个小切口。从尾端开始向头端（鼻部）方向剪开。利用断头后形成的开口深入皮肤下方进行操作。
   1. 切开后，将一侧大脑半球掀开，然后使用弯头或钩状镊子取出整个大脑。
3. 将大脑放入一个新的50 mL离心管中，加入0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，于37 °C水浴中孵育15分钟。每只大脑使用2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液。
4. 用新鲜培养基（含10%胎牛血清（FBS）、DMEM/F12培养基、1%青霉素/链霉素、1% L-谷氨酰胺、1%丙酮酸钠和1%非必需氨基酸）清洗大脑，加入并吸除培养基，重复此步骤4次。
5. 每只大脑接种两个含有培养基的T-75培养瓶。因此，在离心管中每只大脑加入2 mL培养基。最终每只T-75培养瓶中相当于含有1 mL匀浆脑组织和8-9 mL培养基。
6. 使用不同口径的移液管依次由大到小进行吹打，以匀浆大脑组织。当观察到脑组织不再进一步变小时，更换至下一个更小口径的移液管。吹打结束时，悬液应呈透明状，无可见组织块。
   1. 依次使用25 mL、5 mL和10 mL移液管。
7. 将每份均一的脑悬液通过70 µm细胞滤器，以获得单细胞悬液。
8. 对于每份匀浆后的大脑组织，按照步骤1.5所述，接种两个含有培养基的T-75培养瓶（每瓶含1 mL匀浆脑组织和8-9 mL培养基）。
9. 培养6天后更换培养基，并继续培养至第16^th 天进行分离。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12 (1:1) (1x)	Life Technologies	11330057
丙酮酸钠	Life Technologies	11360070
MEM 非必需氨基酸 (100x)	Life Technologies	11140050
L-谷氨酰胺 (100x)	Life Technologies	25030081
EDTA	Fisher Scientific	AM9260G
胎牛血清	Sigma	13H469
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco by Life Technologies	25200