将人诱导性多能干细胞分化为类似小胶质细胞

摘要

来源：Funes, S. 等人， 人源类小胶质细胞：由诱导性多能干细胞分化而来及 体外 利用人突触体进行活细胞吞噬作用检测 视频实验杂志 (2022)

本视频展示了将人类多能细胞分化为类似小胶质细胞的过程。该过程包括形成类胚体，将其转移至包被的孔板中，并使用特定的生长因子诱导其分化为原始巨噬细胞前体，最终进一步分化为类似小胶质细胞的细胞。

方案

1. 小胶质细胞分化

注意： 本实验方案的概述见图1。

1. 诱导性多能干细胞（iPSC）培养
   注意： 有关iPSC培养技术的更多详细信息可参见其他文献。
   1. 解冻与维持培养
      1. 配制iPSC培养基，分装后于-20 °C保存，最长可保存6个月。分装液在4 °C过夜解冻，解冻后可在1周内使用。使用前将培养基置于室温至少1小时。
      2. 在含有钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，将层粘连蛋白521稀释至10 µg/mL，每孔加入1 mL涂布6孔板。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育至少2小时，或更佳为过夜。稀释后的层粘连蛋白于4 °C保存，最长可保存3个月。
      3. 将Rho激酶抑制剂Y27632（ROCK抑制剂）用无菌水稀释，配制成10 mM的储存液。将ROCK抑制剂溶液分装为单次使用量，于-20 °C保存，最长可保存1年。
      4. 用DPBS稀释0.5 M的EDTA储存液，配制0.5 mM的乙二胺四乙酸（EDTA）工作液。
      5. 解冻冻存的iPSC时，将冻存管置于37 °C水浴中，直至大部分冰晶融化。立即将管内液体转移至含4 mL iPSC培养基的15 mL锥形管中，于500 × g离心1分钟。
      6. 吸除上清液，沿管壁缓慢加入含10 µM ROCK抑制剂的1 mL iPSC培养基，轻轻重悬细胞，避免破坏细胞集落。
      7. 在每个已包被的孔中加入1.5 mL含10 µM ROCK抑制剂的iPSC培养基，将重悬的细胞集落逐滴转移至含培养基的孔中。
         注意： 用于常规传代培养时，可使用步骤1.1.1.6中的5–7滴细胞悬液，但应根据每种iPSC细胞系优化接种密度。
      8. 通过手动前后左右轻摇培养板，使细胞在孔内均匀分布，随后将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中。次日，完全更换为不含ROCK抑制剂的新鲜iPSC培养基。
      9. 维持培养期间，每日更换培养基，直至细胞融合度达到80%。
         注意： 若所用iPSC培养基支持灵活的换液周期，可允许连续2天不更换培养基。建议每代仅使用一次，且仅适用于细胞融合度低于50%的情况。
   2. 传代
      1. 吸除培养基，用1 mL不含钙和镁的DPBS洗涤细胞。
      2. 加入1 mL 0.5 mM EDTA，室温孵育2–3分钟，直至细胞集落边缘从孔底脱离。再次用DPBS洗涤细胞，然后加入1 mL iPSC培养基。
      3. 使用细胞刮轻轻刮取，使细胞集落解离。每个区域仅刮取一次，以避免破坏集落。
         注意： 其他使集落脱离孔底的方法可参见其他文献。
      4. 用1 mL移液器吸头收集细胞，按1:6（细胞:培养基）的比例，逐滴加入已预先包被（如步骤1.1.1.2所述）并含1.5 mL iPSC培养基的孔中。

2. iPSC 向类小胶质细胞（iMGs）的分化

注意： 小分子和生长因子溶解于经无菌过滤的含0.1%牛血清白蛋白的DPBS中，配制成比终浓度高1,000倍的储存液。建议在iPSC早期传代阶段将其分化为iMG。建议对iPSC细胞系进行常规核型分析。

1. 准备标准包被溶液
   1. 将细胞外基质包被试剂的储存液置于冰上，在 4 °C 下过夜解冻。
   2. 将微量离心管和滤芯吸头在 4 °C 预冷。
   3. 将 250 µL 浓缩的细胞外基质包被试剂分装至各管中，立即置于冰上，并将分装样品储存在 -20 °C。
   4. 为制备包被溶液，将一份细胞外基质包被试剂分装样品置于冰上，在 4 °C 下过夜解冻。
   5. 向预冷的锥形管中加入 50 mL 冰冷的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基/营养混合物 F12（DMEM-F12），该培养基适用于人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的生长（以下简称 DMEM-F12），并保持在冰上。
   6. 通过反复吸取冰冷新鲜 DMEM-F12 多次，使 1 mL 吸头预冷，然后立即用该吸头将 250 µL 细胞外基质包被试剂转移至含有 DMEM-F12 培养基的锥形管中。
      注意：标准包被溶液可在 4 °C 下保存 2 周。
2. 拟胚体（EB）形成
   1. 制备 EB 培养基，该培养基可在 4 °C 下保存最多 4 天。
   2. 当 iPSCs 达到 80% 汇合度时，用 1 mL DPBS 洗涤细胞，加入 1 mL 解离试剂，在 37 °C 下孵育 2 分钟。使用细胞刮刀多次刮擦，使细胞集落脱落，形成单细胞悬液。收集细胞，并将全部内容物转移至含有 9 mL DPBS 的 15 mL 锥形管中。
   3. 以 500 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于 1 mL EB 培养基中。取 10 µL 细胞悬液，与台盼蓝按 1:1 比例稀释，使用血细胞计数板进行细胞计数，并根据计数结果将细胞悬液稀释至最终浓度为每 100 µL 含 10,000 个细胞。接种时，将 100 µL 稀释后的细胞悬液加入低黏附性、圆底 96 孔板的每一孔中。
      注意：通常，每个 80% 汇合度的 iPSCs 孔可获得 96 孔板中约 48 个孔的细胞量。
   4. 将 96 孔板以 125 × g 离心 3 分钟，随后在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 4 天。在第 2 天进行半量换液：使用多通道移液器小心吸取 50 µL 旧培养基，再加入 50 µL 新鲜 EB 培养基。
      注意：第 4 天时，iPSCs 将形成球形细胞结构，即拟胚体（EBs），如结果部分所述。如有需要，EB 分化过程可延长至 7 天。
3. 原始巨噬细胞前体（PMPs）的生成
   1. 制备 PMP 基础培养基，经无菌过滤后，可在 4 °C 下保存最多 1 个月。
   2. 向 6 孔板的各孔中加入 1 mL 冰冷的 Matrigel 包被溶液，进行包被处理，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育至少 2 小时，或更佳为过夜。
   3. 在 EB 分化第 4 天，使用移液器配合 1 mL 吸头收集 EBs，并将其转移至 Matrigel 包被的孔中。轻轻吹打 1-2 次，使 EBs 从孔壁脱落。将 6 孔板倾斜放置，使 EBs 沉降至孔边缘。
      注意：每个包被孔可接种 9 至 10 个 EBs。
   4. 待所有 EBs 沉降后，使用 1 mL 吸头小心吸取并移除旧培养基，同时保持 EBs 位于孔边缘。向每孔加入 3 mL 新鲜配制的 PMP 完全培养基。通过手动前后左右轻摇培养板，使细胞在孔内均匀分布。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育。
   5. 孵育 7 天内不要扰动培养板，以允许 EBs 附着于孔底。此后，使用 PMP 完全培养基进行半量换液。
      注意：此时大多数 EBs 应已附着于培养板表面。任何未附着的漂浮 EBs 可予以去除。
   6. 5-7 天后，在 4 倍明场显微镜下观察 EBs，确认其已附着于孔底。按照步骤 1.2.3.5 所述进行换液。在第 21 天，使用 3 mL PMP 完全培养基进行全量换液。
      注意：此时培养基中可能出现漂浮的髓系祖细胞。这些细胞应在换液过程中弃去。
   7. 第 28 天，观察上清液中出现的圆形细胞，即 PMPs，使用 10 mL 吸头和自动移液器小心收集含 PMPs 的培养基。注意不要扰动 EBs。将 PMPs 及其培养基转移至 15 mL 锥形管中，并按步骤 1.2.4 所述继续操作。
      注意：通常可从 6 孔板的五个孔中收集同一 iPSC 系来源的 PMPs，并合并至一个 15 mL 锥形管中。
   8. 向各孔补充 3 mL 新鲜 PMP 完全培养基，以维持 EBs 的继续培养。由于 PMPs 可持续从 EBs 中释放超过 3 个月，应每隔 4-7 天收集一次（注意避免培养基颜色变为黄色），具体操作如步骤 1.2.3.7 和 1.2.3.8 所述。
      注意：尽管 PMPs 可持续收集数月，但其表型可能随时间发生变化。
4. iMGs 的分化
   1. 制备 iMG 基础培养基（见材料表），经无菌过滤后，可在 4 °C 下保存最多 3 周。
   2. 将收集的 PMPs 转移至 15 mL 锥形管后，以 200 × g 离心 4 分钟。吸除上清液，使用 1-2 mL iMG 基础培养基重悬 PMPs。取少量细胞悬液，与台盼蓝按 1:1 比例稀释，使用血细胞计数板进行细胞计数。
      ​注意：通常每周可获得 0.5-1.5 × 10⁶ 个 PMPs，具体数量取决于 iPSC 系及 EB 培养的时长。
   3. 将剩余细胞再次以 200 × g 离心 4 分钟。将 PMPs 稀释至所需浓度，使用新鲜配制的 iMG 完全培养基，以约 10⁵/cm² 的密度接种于细胞培养处理过的培养板上。在整个 10-12 天的分化过程中，每隔 3-4 天使用新鲜配制的 iMG 完全培养基进行半量换液，以促进终末分化。
      注意：此时细胞应呈现小胶质细胞样形态。为确认 PMPs 向小胶质细胞谱系的定向分化，需进行免疫荧光分析，以验证小胶质细胞富集标志物（如嘌呤能受体 P2RY12 和跨膜蛋白 119（TMEM119））的表达。
   4. 为保持细胞健康与活力，所有实验应在 iMG 分化第 10 至 12 天之间进行。

结果

图1：将iPSC分化为类小胶质细胞的方案示意图。 第0天，当iPSC达到80%融合度时，将细胞集落解离为单细胞，并在EB培养基中培养以诱导形成类胚体（EB）。第4天，收集EB并接种于PMP培养基中，以诱导原始巨噬细胞前体（PMP）的生成。28天后，收集PMP，并使用iMG培养基将其终末分化为类小胶质细胞（iMG）。PMP可每周收集一次，持续长达3个月。缩写：iPSCs = 诱导性多能干细胞；iMGs = 类小胶质细胞；EB = 类胚体；PMP = 原始巨噬细胞前体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养材料
6孔板	Greiner Bio-One	657160
100 mm × 20 mm 组织培养处理	CELLTREAT	229620
细胞刮刀，双头，平刃 & 窄刃，无菌	CELLTREAT	229305
低吸附圆底96孔板	康宁	7007
Primaria 24孔平底表面修饰多孔细胞培养板	康宁	353847,
Primaria 6孔细胞培养板，平底，表面修饰	康宁	353846
Primaria 96孔透明平底微孔板	康宁	353872
细胞解离试剂
Accutase	康宁	25058CI	用于下运动神经元分化的解离试剂
TrypLE 试剂	Life Technologies	12-605-010	用于小胶质细胞分化的解离试剂
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0	Invitrogen	15575020
细胞培养用包被试剂
Matrigel GFR 基底膜基质	康宁™	354230	称为细胞外基质包被试剂
CellAdhere 层粘连蛋白-521	STEMCELL 技术	77004	称为层粘连蛋白521
聚-D-赖氨酸	Sigma	P7405	用硼酸盐缓冲液重悬至 0.1 mg/mL
聚-L-鸟氨酸	Sigma	P3655	用硼酸盐缓冲液重悬至 1 mg/mL
组成部分 iPSC 培养基
mTeSR Plus 试剂盒	STEMCELL 技术	100-0276	准备 iPSC 培养基 将各组分混合至1x
组成部分 EB培养基
BMP-4	Fisher Scientific	PHC9534	终浓度 50 ng/mL
iPSC 培养基			终浓度 1x
ROCK抑制剂Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	终浓度 10 µM
SCF	PeproTech	300-07	终浓度 20 ng/mL
VEGF	PeproTech	100-20A	终浓度 50 ng/mL
组成部分 PMP基础培养基
GlutaMAX	Gibco	35050061	终浓度 1x
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140122	终浓度 100 U/mL
X-VIVO 15	Lonza	12001-988	终浓度 1x
组成部分 PMP 完全培养基
55 mM 2-巯基乙醇	Gibco	21985023	终浓度 55 µM
IL-3	PeproTech	200-03	终浓度 25 ng/mL
M-CSF	PeproTech	300-25	终浓度 100 ng/mL
PMP基础培养基			终浓度 1x
组成部分 iMG 基础培养基
高级DMEM/F12	Gibco	12634010	终浓度 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	终浓度 1x
N2 补充剂，100 倍	Gibco	17502-048	终浓度 1x
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140122	终浓度 100 U/mL
组成部分 iMG 完全培养基
55 mM 2-巯基乙醇	Gibco	21985023	终浓度 55 µM
IL-34	PeproTech 或 Biologend	200-34 或 577904	终浓度 100 ng/mL
iMG 基础培养基			终浓度 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	终浓度 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	终浓度 50 ng/mL
诱导基础培养基的组分
含 HEPES 的 DMEM/F12 培养基	Gibco	11330032	终浓度为1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	终浓度 1x
N2 补充剂，100 倍	Gibco	17502-048	终浓度 1x
非必需氨基酸（NEAA），100 倍浓缩液	Gibco	11140050	终浓度 1x
完全诱导培养基的组分
化合物 E	Calbiochem	565790	终浓度为 0.2 μM，用体积比 1:1 的乙醇和 DMSO 将储备试剂重新配制成 2 mM
多西环素	Sigma	D9891	终浓度为 2 μg/mL，用 DPBS 将储备试剂重悬至 2 mg/mL
诱导基础培养基			终浓度 1x
ROCK抑制剂Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	终浓度 10 μM
其他细胞培养试剂
0.4% 台盼蓝溶液	AMRESCO 公司	K940-100ML
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	22144-77-0
含钙和镁的DPBS	Corning	21-030-CV
不含钙和镁的DPBS	康宁	21-031-CV	称为 DPBS
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	称为专为人类胚胎干细胞和诱导性多能干细胞生长优化的DMEM-F12培养基
小鼠层粘连蛋白，天然蛋白	Gibco	23017015	称为层粘连蛋白