将人诱导性多能干细胞分化为类似小胶质细胞

摘要

来源：Funes, S. 等人， 人源类小胶质细胞：由诱导性多能干细胞分化而来及 体外 利用人突触体进行活细胞吞噬作用检测 视频实验杂志 (2022)

本视频展示了将人类多能细胞分化为类似小胶质细胞的过程。该过程包括形成类胚体，将其转移至包被的孔板中，并使用特定的生长因子诱导其分化为原始巨噬细胞前体，最终进一步分化为类似小胶质细胞的细胞。

方案

1. 小胶质细胞分化

注意： 本实验方案的概述见图1。

1. 诱导性多能干细胞（iPSC）培养
   注意： 有关iPSC培养技术的更多详细信息可参见其他文献。
   1. 解冻与维持培养
      1. 配制iPSC培养基，分装后于-20 °C保存，最长可保存6个月。分装液在4 °C过夜解冻，解冻后可在1周内使用。使用前将培养基置于室温至少1小时。
      2. 在含有钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，将层粘连蛋白521稀释至10 µg/mL，每孔加入1 mL涂布6孔板。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育至少2小时，或更佳为过夜。稀释后的层粘连蛋白于4 °C保存，最长可保存3个月。
      3. 将Rho激酶抑制剂Y27632（ROCK抑制剂）用无菌水稀释，配制成10 mM的储存液。将ROCK抑制剂溶液分装为单次使用量，于-20 °C保存，最长可保存1年。
      4. 用DPBS稀释0.5 M的EDTA储存液，配制0.5 mM的乙二胺四乙酸（EDTA）工作液。
      5. 解冻冻存的iPSC时，将冻存管置于37 °C水浴中，直至大部分冰晶融化。立即将管内液体转移至含4 mL iPSC培养基的15 mL锥形....

结果

图1：将iPSC分化为类小胶质细胞的方案示意图。 第0天，当iPSC达到80%融合度时，将细胞集落解离为单细胞，并在EB培养基中培养以诱导形成类胚体（EB）。第4天，收集EB并接种于PMP培养基中，以诱导原始巨噬细胞前体（PMP）的生成。28天后，收集PMP，并使用iMG培养基将其终末分化为类小胶质细胞（iMG）。PMP可每周收集一次，持续长达3个月。缩写：iPSCs = 诱导性多能干细胞；iMGs = 类小胶质细胞；EB = 类胚体；PMP = 原始巨噬细胞前体。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养材料
6孔板	Greiner Bio-One	657160
100 mm × 20 mm 组织培养处理	CELLTREAT	229620
细胞刮刀，双头，平刃 & 窄刃，无菌	CELLTREAT	229305
低吸附圆底96孔板	康宁	7007
Primaria 24孔平底表面修饰多孔细胞培养板	康宁	353847,
Primaria 6孔细胞培养板，平底，表面修饰	康宁	353846
Primaria 96孔透明平底微孔板	康宁	353872
细胞解离试剂
Accutase	康宁	25058CI	用于下运动神经元分化的解离试剂
TrypLE 试剂	Life Technologies	12-605-010	用于小胶质细胞分化的解离试剂
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0	Invitrogen	15575020
细胞培养用包被试剂
Matrigel GFR 基底膜基质	康宁™	354230	称为细胞外基质包被试剂
CellAdhere 层粘连蛋白-521	STEMCELL 技术	77004	称为层粘连蛋白521
聚-D-赖氨酸	Sigma	P7405	用硼酸盐缓冲液重悬至 0.1 mg/mL
聚-L-鸟氨酸	Sigma	P3655	用硼酸盐缓冲液重悬至 1 mg/mL
组成部分 iPSC 培养基
mTeSR Plus 试剂盒	STEMCELL 技术	100-0276	准备 iPSC 培养基 将各组分混合至1x
组成部分 EB培养基
BMP-4	Fisher Scientific	PHC9534	终浓度 50 ng/mL
iPSC 培养基			终浓度 1x
ROCK抑制剂Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	终浓度 10 µM
SCF	PeproTech	300-07	终浓度 20 ng/mL
VEGF	PeproTech	100-20A	终浓度 50 ng/mL
组成部分 PMP基础培养基
GlutaMAX	Gibco	35050061	终浓度 1x
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140122	终浓度 100 U/mL
X-VIVO 15	Lonza	12001-988	终浓度 1x
组成部分 PMP 完全培养基
55 mM 2-巯基乙醇	Gibco	21985023	终浓度 55 µM
IL-3	PeproTech	200-03	终浓度 25 ng/mL
M-CSF	PeproTech	300-25	终浓度 100 ng/mL
PMP基础培养基			终浓度 1x
组成部分 iMG 基础培养基
高级DMEM/F12	Gibco	12634010	终浓度 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	终浓度 1x
N2 补充剂，100 倍	Gibco	17502-048	终浓度 1x
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140122	终浓度 100 U/mL
组成部分 iMG 完全培养基
55 mM 2-巯基乙醇	Gibco	21985023	终浓度 55 µM
IL-34	PeproTech 或 Biologend	200-34 或 577904	终浓度 100 ng/mL
iMG 基础培养基			终浓度 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	终浓度 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	终浓度 50 ng/mL
诱导基础培养基的组分
含 HEPES 的 DMEM/F12 培养基	Gibco	11330032	终浓度为1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	终浓度 1x
N2 补充剂，100 倍	Gibco	17502-048	终浓度 1x
非必需氨基酸（NEAA），100 倍浓缩液	Gibco	11140050	终浓度 1x
完全诱导培养基的组分
化合物 E	Calbiochem	565790	终浓度为 0.2 μM，用体积比 1:1 的乙醇和 DMSO 将储备试剂重新配制成 2 mM
多西环素	Sigma	D9891	终浓度为 2 μg/mL，用 DPBS 将储备试剂重悬至 2 mg/mL
诱导基础培养基			终浓度 1x
ROCK抑制剂Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	终浓度 10 μM
其他细胞培养试剂
0.4% 台盼蓝溶液	AMRESCO 公司	K940-100ML
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	22144-77-0
含钙和镁的DPBS	Corning	21-030-CV
不含钙和镁的DPBS	康宁	21-031-CV	称为 DPBS
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	称为专为人类胚胎干细胞和诱导性多能干细胞生长优化的DMEM-F12培养基
小鼠层粘连蛋白，天然蛋白	Gibco	23017015	称为层粘连蛋白