建立从小鼠视网膜获取的穆勒胶质细胞培养体系

摘要

来源：Kang, S.，等。利用原代细胞培养研究微小RNA处理后小鼠穆勒胶质细胞的再生潜能。J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了从小鼠视网膜中分离的穆勒胶质细胞（MG细胞）的培养过程。视网膜通过消化酶处理解离为单细胞悬液。随后，细胞在含有促进MG细胞增殖和神经元细胞死亡的生长因子的培养基中培养。在传代过程中去除死亡的神经元细胞，继续培养MG细胞以用于后续分析。

方案

免责声明： 所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

1. 视网膜解离

注意：所有后续步骤（直至细胞收获）均需在 A2 或 B2 级生物安全柜（BSC）中进行。

1. 按如下方法配制木瓜蛋白酶/脱氧核糖核酸酶 I 解离混合液。
   1. 对于六块视网膜，在含有750 µL木瓜蛋白酶的试管中加入75 µL DNase I，并小心混匀（解离混合液）。
   2. 对于本方案所需的单个样品制备，将总体积825 µL分为三份等分试样：每只小鼠（两个视网膜）取275 µL混合液置于一个1.5 mL离心管中。根据此比例相应计算DNase I和Papain的所需用量。
      注意： 一个Papain/DNase I混合液管中最多可处理六只视网膜。然而，单独制备样本所形成的团块更少，细胞生长效果优于合并样本。
2. 将两个视网膜转移至含有木瓜蛋白酶/DNase I 的消化混合液中。使用尖端直径增大的移液管，吸取视网膜，待视网膜沉降至管尖底部后，将其释放至含有木瓜蛋白酶/DNase I 混合液的离心管中，注意避免带入过多的Hanks平衡盐溶液（HBSS）。
3. 置于摇床上，在细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中孵育10分钟₂).
4. 用1 mL移液器轻轻吹打细胞20-30次，使细胞解离。当细胞完全解离（即形成均匀悬液且无团块）后，加入275 µL来自木瓜蛋白酶解离试剂盒的卵类黏蛋白蛋白酶抑制剂，以中和木瓜蛋白酶。通过移液器轻轻吹打混匀。 注：若在825 µL木瓜蛋白酶/DNase I混合液中解离了六片视网膜，则需加入825 µL卵类黏蛋白抑制剂。
5. 在 4 °C 条件下，以 300 x g 离心 10 分钟。
6. 向预热至 37 °C 的生长培养基（每只小鼠 1 mL）中加入表皮生长因子（EGF，每 1 mL 培养基添加 1 µL，用 PBS 重悬至 200 µg/mL）。
   注意根据实验设计，可在培养开始时加入增殖标记物5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）、4-羟基他莫昔芬（4-OHT）或其他所需因子。
7. 小心地从离心机中取出离心管，切勿触碰管底的沉淀物。
8. 小心且彻底地移除上清液。用500 µL添加了EGF的生长培养基重悬细胞沉淀。
9. 将细胞悬液转移至已标记的12孔板中的一个孔内（图1C）。用另外500 µL含EGF的生长培养基冲洗离心管，并将冲洗液加入孔中（每孔总体积为1 mL）。
10. 对所有其他样本重复步骤 1.8 和 1.9。
11. 轻轻来回（前后、左右）摇动培养板三次。将培养板放入培养箱中（37 °C，CO₂).
    注意： 若使用转基因小鼠，应对每只动物进行基因分型（图1D). 鉴别Cre重组酶阳性与阴性小鼠，并相应标记培养板。本方案中，仅使用Cre重组酶阳性报告小鼠的细胞进行后续步骤。Cre阴性样本的细胞则冻存，用于其他用途。

2. 生长期

注意： 生长阶段持续约4-5天（图2B）。向含有细胞的孔中添加液体时，移液器应指向孔壁，并缓慢释放液体，以避免细胞脱落。切勿直接将液体滴加在细胞上方。

1. 解离后一天，移除培养基并加入 1 mL 新鲜的含 EGF 生长培养基。
2. 第 3 天，移除培养基并加入 1 mL HBSS（室温）以去除细胞碎片。轻轻左右来回摇晃。移除 HBSS，重复洗涤步骤，然后加入 1 mL 预热的含 EGF 生长培养基。
3. 每天监测细胞，评估其生长状态，直至细胞达到 90%–100% 汇合度。图 3 展示了 MG 细胞随时间良好生长的一个示例。检查是否存在污染或细胞死亡现象。弃用受污染的培养物。
   注意：为监测和记录细胞状态，可使用配备相机的光学显微镜，结合 4x、10x 或 20x 物镜，在不同放大倍数下拍摄图像。本研究中使用荧光显微镜。

3. 使用多聚-L-鸟氨酸（Poly-O）和层粘连蛋白包被盖玻片的制备

注意：仅当进行免疫荧光标记和共聚焦激光扫描显微镜观察时，此步骤才为必要。为获得理想的成像效果，需使用圆形玻璃盖玻片（直径12 mm）。涂层操作步骤亦可参见神经元培养基产品说明书（见材料表）。

1. 使用无菌杜蒙特 #2AP 镊子，将无菌盖玻片小心地放置于 24 孔板每个孔的中央。
   注意：需将盖玻片置于孔的中央位置。若盖玻片靠近孔壁，将在后续步骤中引起表面张力问题。
2. 在室温下解冻一份 2.5 mL 的 Poly-O 分装液，并将其中 100 µL 加至每张盖玻片的中央。
3. 将 24 孔板置于 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。
4. 吸除 Poly-O，并用约 1 mL 无菌水对含盖玻片的孔进行三次洗涤。
5. 将 24 孔板置于生物安全柜中过夜干燥。同时，在 4 °C 下过夜解冻 2.5 mL 层粘连蛋白（Laminin）。
6. 次日早晨，向每张盖玻片中央加入 100 µL 层粘连蛋白（Laminin），并在 37 °C 培养箱中孵育 4 小时。
7. 小心且彻底地吸除层粘连蛋白（Laminin）。
8. 若无法立即进行传代操作，请将 24 孔板保存于 4 °C。
   注意：已包被的盖玻片在 4 °C 下可保存数天。

4. 细胞传代以去除存活的神经元

注意：细胞传代的目的是去除神经元细胞，而不是增加细胞数量。胶质细胞仅能分裂少数几次，传代后将不再继续生长。不要稀释细胞悬液。一个12孔板中长满细胞的一个孔中的细胞，可分配至另一个12孔板的一个孔，或24孔板的两个孔中。当使用包被的盖玻片时，仅约三分之一的盖玻片表面被包被。因此，从一个12孔板的汇合细胞孔（约80%–90%汇合度）可获得24孔板中六个带有汇合细胞的盖玻片。也可根据需要选择其他比例以调节细胞密度。本实验方案中使用一只Cre+报告基因小鼠 [一次实验，两种处理：miR-25 或对照miR；技术重复数 n = 3（每种处理三个盖玻片），生物学重复数 n = 1]。技术重复和生物学重复的数量可根据具体实验设计另行设定。

1. 检查细胞是否已达到90%-100%汇合度（包括孔的边缘；图3E,F）。
2. 移除培养基，加入1 mL HBSS（室温）洗涤。轻轻摇动培养板（前后、左右方向），然后完全移除HBSS。
3. 加入500 µL预热的含胰蛋白酶溶液（在金属珠浴中37 °C预热），使细胞从孔底脱落。轻轻摇动（前后、左右方向），在37 °C培养箱中孵育2分钟。
4. 将培养板从培养箱转移至生物安全柜。倾斜培养板，吸除含胰蛋白酶的溶液，并缓慢、轻柔地在孔内反复吹打数次，直至细胞完全脱落。将培养板对着光源观察，确保底部无残留细胞。
5. 将该细胞悬液转移至无菌的1.5 mL离心管中。在4 °C下以300 × g离心8分钟。
6. 移除上清液，通过加入600 µL预热的生长培养基（添加EGF，1:1000）重悬细胞沉淀（每孔6孔板/盖玻片对应100 µL），并上下吹打约30-40次。
   注意： 此时可按照标准细胞系复苏方案，将细胞在-80 °C或液氮中冷冻保存。若进行冷冻，细胞不应使用含EGF的培养基（生长培养基）重悬，而应使用基础培养基（不含EGF）与冻存液（1:1比例）重悬。
7. 取600 µL细胞/培养基悬液中的100 µL，接种于24孔板中六个已包被的盖玻片中央（见步骤5）。小心将培养板放入培养箱，使细胞沉降。
   注意： 从12孔板的一个孔收获的600 µL细胞悬液中取100 µL接种，可达到90%-100%的细胞汇合度，此为转染所需条件。
8. 3小时后观察细胞，确认其是否已贴附于盖玻片上，随后加入400 µL添加EGF的生长培养基。
   注意： 细胞通常在次日即可用于转染（图3G）。若未达到90%-100%汇合度，可继续培养一天；若仍未能汇合，则不应用于转染。若进行其他下游实验，如miRNA表达谱分析、RNA-Seq、RT-qPCR或Western blot，则需将细胞以1:1比例传代至12孔板（无需包被处理），并用于RNA/蛋白提取。

结果

图1： 视网膜组织解离与基因分型。（A）去除角膜、晶状体、虹膜和玻璃体后的眼球杯状结构。（B）分离得到的视网膜；经充分洗涤后去除视网膜色素上皮（RPE）细胞。（C）含有解离后视网膜的12孔板（每孔两片视网膜）。（D）基因分型凝胶电泳图像示例的局部放大图。需要进行基因分型以鉴定携带由Ascl1驱动的Cre重组酶表达的小鼠，这些小鼠将用于追踪细胞转化过程。比例尺：1 mm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物
Ascl1-CreERT 小鼠 Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J	Jax 实验室	#012882	Ascl1-CreERT 小鼠与 tdTomato 小鼠杂交
tdTomato-STOPfl/fl 小鼠 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	Jax 实验室	#007914	需要进行基因分型以鉴定 Ascl1CreER 阳性小鼠
试剂
聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P4538-50MG	用无菌水重悬，分装后冷冻保存
N-2 补充剂	Fisher Scientific	17-502-048	分装后冷冻保存
Neurobasal 培养基	Fisher Scientific	21-103-049	用于第 1.1 节中的生长培养基，4 °C 保存
木瓜蛋白酶解离系统	Worthington Biochemical	LK003153	用 Earle's 平衡盐溶液重悬，分装后冷冻保存
青霉素-链霉素	Fisher Scientific	15-140-122	分装后冷冻保存
L-谷氨酰胺	Fisher Scientific	25-030-081	分装后冷冻保存
HBSS	Fisher Scientific	14-025-134	4 °C 保存
胎牛血清 (FBS)	Fisher Scientific	MT35010CV	分装后冷冻保存
塑料器皿/耗材
0.6 mL 微量离心管	Fisher Scientific	50-408-120
1.5 mL 微量离心管	Fisher Scientific	50-408-129
10 µL TIP 无菌滤芯吸头	Fisher Scientific	02-707-439
100 µL TIP 无菌滤芯吸头	Fisher Scientific	02-707-431
1000 µL TIP 无菌滤芯吸头	Fisher Scientific	02-707-404
2.0 mL 微量离心管	Fisher Scientific	50-408-138
20 µL TIP 无菌滤芯吸头	Fisher Scientific	02-707-432
可调体积移液器 (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL)	Eppendorf	2231300008
一次性转移移液管	Fisher Scientific	13-669-12
带盖多孔平底培养板，孔数=12	Fisher Scientific	08-772-29
带盖多孔平底培养板，孔数=24	Fisher Scientific	08-772-1
PIPET 无菌滤芯 10 mL 一次性血清移液管	Fisher Scientific	13-676-10J
PIPET 无菌滤芯 50 mL 一次性血清移液管	Fisher Scientific	13-676-10Q
PIPET 无菌滤芯 5 mL 一次性血清移液管	Fisher Scientific	13-676-10H
无粉腈类检查手套	Fisher Scientific	19-130-1597B
圆形盖玻片（直径 12 mm，厚度 0.17 - 0.25 mm）	Fisher Scientific	22293232
真空滤器，孔径=0.22 µm	Fisher Scientific	09-761-106
设备
1300 B2 生物安全柜	Thermo Scientific	1310
一体化荧光显微镜 Keyence BZ-X 810	Keyence	9011800000
双目光学变倍体视显微镜	Vision Scientific	VS-1EZ-IFR07
一次性培养皿（直径 100 mm）	VWR	25384-088
Dumont #5 镊子 - 生物学/钛合金	Fine Science Tools	11252-40
Dumont #55 镊子 - 生物学/不锈钢	Fine Science Tools	11255-20
Dumont #7 弯头镊子 - 生物学/钛合金	Fine Science Tools	11272-40
Eppendorf 离心机 5430 R	Eppendorf	2231000508
水套式 CO2 培养箱	VWR	10810-744