建立从小鼠视网膜获取的穆勒胶质细胞培养体系

摘要

来源：Kang, S.，等。利用原代细胞培养研究微小RNA处理后小鼠穆勒胶质细胞的再生潜能。J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了从小鼠视网膜中分离的穆勒胶质细胞（MG细胞）的培养过程。视网膜通过消化酶处理解离为单细胞悬液。随后，细胞在含有促进MG细胞增殖和神经元细胞死亡的生长因子的培养基中培养。在传代过程中去除死亡的神经元细胞，继续培养MG细胞以用于后续分析。

方案

免责声明： 所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

1. 视网膜解离

注意：所有后续步骤（直至细胞收获）均需在 A2 或 B2 级生物安全柜（BSC）中进行。

1. 按如下方法配制木瓜蛋白酶/脱氧核糖核酸酶 I 解离混合液。
   1. 对于六块视网膜，在含有750 µL木瓜蛋白酶的试管中加入75 µL DNase I，并小心混匀（解离混合液）。
   2. 对于本方案所需的单个样品制备，将总体积825 µL分为三份等分试样：每只小鼠（两个视网膜）取275 µL混合液置于一个1.5 mL离心管中。根据此比例相应计算DNase I和Papain的所需用量。
      注意： 一个Papain/DNase I混合液管中最多可处理六只视网膜。然而，单独制备样本所形成的团块更少，细胞生长效果优于合并样本。
2. 将两个视网膜转移至含有木瓜蛋白酶/DNase I 的消化混合液中。使用尖端直径增大的移液管，吸取视网膜，待视网膜沉降至管尖底部后，将其释放至含有木瓜蛋白酶/DNase I 混合液的离心管中，注意避免带入过多的Hanks平衡盐溶液（HBSS）。
3. 置于摇床上，在细胞培养箱....

结果

图1： 视网膜组织解离与基因分型。（A）去除角膜、晶状体、虹膜和玻璃体后的眼球杯状结构。（B）分离得到的视网膜；经充分洗涤后去除视网膜色素上皮（RPE）细胞。（C）含有解离后视网膜的12孔板（每孔两片视网膜）。（D）基因分型凝胶电泳图像示例的局部放大图。需要进行基因分型以鉴定携带由Ascl1驱动的Cre重组酶表达的小鼠，这些小鼠将用于追踪细胞转化过程。比例尺：1 mm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物
Ascl1-CreERT 小鼠 Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J	Jax 实验室	#012882	Ascl1-CreERT 小鼠与 tdTomato 小鼠杂交
tdTomato-STOPfl/fl 小鼠 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	Jax 实验室	#007914	需要进行基因分型以鉴定 Ascl1CreER 阳性小鼠
试剂
聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P4538-50MG	用无菌水重悬，分装后冷冻保存
N-2 补充剂	Fisher Scientific	17-502-048	分装后冷冻保存
Neurobasal 培养基	Fisher Scientific	21-103-049	用于第 1.1 节中的生长培养基，4 °C 保存
木瓜蛋白酶解离系统	Worthington Biochemical	LK003153	用 Earle's 平衡盐溶液重悬，分装后冷冻保存
青霉素-链霉素	Fisher Scientific	15-140-122	分装后冷冻保存
L-谷氨酰胺	Fisher Scientific	25-030-081	分装后冷冻保存
HBSS	Fisher Scientific	14-025-134	4 °C 保存
胎牛血清 (FBS)	Fisher Scientific	MT35010CV	分装后冷冻保存
塑料器皿/耗材
0.6 mL 微量离心管	Fisher Scientific	50-408-120
1.5 mL 微量离心管	Fisher Scientific	50-408-129
10 µL TIP 无菌滤芯吸头	Fisher Scientific	02-707-439
100 µL TIP 无菌滤芯吸头	Fisher Scientific	02-707-431
1000 µL TIP 无菌滤芯吸头	Fisher Scientific	02-707-404
2.0 mL 微量离心管	Fisher Scientific	50-408-138
20 µL TIP 无菌滤芯吸头	Fisher Scientific	02-707-432
可调体积移液器 (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL)	Eppendorf	2231300008
一次性转移移液管	Fisher Scientific	13-669-12
带盖多孔平底培养板，孔数=12	Fisher Scientific	08-772-29
带盖多孔平底培养板，孔数=24	Fisher Scientific	08-772-1
PIPET 无菌滤芯 10 mL 一次性血清移液管	Fisher Scientific	13-676-10J
PIPET 无菌滤芯 50 mL 一次性血清移液管	Fisher Scientific	13-676-10Q
PIPET 无菌滤芯 5 mL 一次性血清移液管	Fisher Scientific	13-676-10H
无粉腈类检查手套	Fisher Scientific	19-130-1597B
圆形盖玻片（直径 12 mm，厚度 0.17 - 0.25 mm）	Fisher Scientific	22293232
真空滤器，孔径=0.22 µm	Fisher Scientific	09-761-106
设备
1300 B2 生物安全柜	Thermo Scientific	1310
一体化荧光显微镜 Keyence BZ-X 810	Keyence	9011800000
双目光学变倍体视显微镜	Vision Scientific	VS-1EZ-IFR07
一次性培养皿（直径 100 mm）	VWR	25384-088
Dumont #5 镊子 - 生物学/钛合金	Fine Science Tools	11252-40
Dumont #55 镊子 - 生物学/不锈钢	Fine Science Tools	11255-20
Dumont #7 弯头镊子 - 生物学/钛合金	Fine Science Tools	11272-40
Eppendorf 离心机 5430 R	Eppendorf	2231000508
水套式 CO2 培养箱	VWR	10810-744