使用荧光激活细胞核分选技术从脑组织中分离细胞群体

摘要

来源：Mussa, Z.，等。利用荧光激活细胞核分选技术从新鲜冷冻大脑皮层中分离成人人类星形胶质细胞群体。J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了使用荧光激活细胞核分选（FANS）从新鲜冷冻的人脑组织中分离和分选细胞核的实验步骤，该方法可用于研究不同细胞群体在多种神经科学领域的应用。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 缓冲液的配制

注意：如果进行后续的RNA测序，需使用RNase去污染溶液彻底处理所有工作区域和工具，以防止mRNA降解。

1. 配制裂解缓冲液。
   1. 将以下成分溶于蒸馏水（H₂O）中，定容至 50 mL：5.47 g 蔗糖（终浓度 0.32 M）、250 µL 1 M 氯化钙（CaCl₂）（终浓度 5 mM）、150 µL 1 M 醋酸镁（Mg(CH₃COO)₂）（终浓度 3 mM）、10 µL 500 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）（终浓度 0.1 mM）、500 µL 1 M 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）（pH 8）（终浓度 10 mM）、50 µL Triton X-100（终浓度 0.1%）以及 17 µL 3 M 二硫苏糖醇（DTT，终浓度 1 mM，现用现加）（参见材料表）。
2. 配制蔗糖缓冲液
   1. 将以下成分溶于蒸馏水（H₂O）中，定容至 50 mL：30.78 g 蔗糖（终浓度 1.8 M）、150 µL 1 M 醋酸镁（Mg(CH₃

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x PBS pH 7.2	Invitrogen	70013073
抗 NeuN 抗体克隆 A60	Millipore	MAB377A5MI	与荧光化合物 AF555 偶联的小鼠抗 NeuN 抗体（激发波长 553 nm；发射波长 568 nm）
抗 OLIG2 抗体克隆 211	Millipore	MABN50A4MI	与荧光化合物 AF488 偶联的小鼠抗 OLIG2 抗体（激发波长 499 nm；发射波长 520 nm）
牛血清白蛋白	Fisher	BP9704-100
亮线计数板	Hausser Scientific	3110V
无水氯化钙	Fisher	C614-3
细胞筛网，40 µM	SP Scienceware	136800040
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）	Invitrogen	D1306
邓氏组织研磨器	WHEATON	357542
FACS 分选仪	BD Biosciences		BD FACSAria III
四水合乙酸镁	Fisher	M13-500
PAX6（PAX6/496）— 100 次检测	Novus	NBP234705J
蔗糖，晶体级，ACS 级，500 mg	Fisher	S5500
SW 41 Ti 摆动桶转子	Beckman Coulter	331362
Tris-HCl，1M 溶液，pH 8.0，分子生物学级，超纯	Thermo Scientific	J22638AE
TritonX-100	Fisher	BP151-500	裂解缓冲液中的非离子型表面活性剂
台盼蓝溶液，0.4%	Gibco	15250061
超速离心机	Beckman Coulter Optima XE-100	A94516
超速离心管 PP 9/16 × 3-1/2	Beckman Coulter	331372
超纯蒸馏水（无 RNase、DNase）	Invitrogen	10977023	简称蒸馏水
超纯 EDTA	Life Technologies	15576-028