使用荧光激活细胞核分选技术从脑组织中分离细胞群体

摘要

来源：Mussa, Z.，等。利用荧光激活细胞核分选技术从新鲜冷冻大脑皮层中分离成人人类星形胶质细胞群体。J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了使用荧光激活细胞核分选（FANS）从新鲜冷冻的人脑组织中分离和分选细胞核的实验步骤，该方法可用于研究不同细胞群体在多种神经科学领域的应用。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 缓冲液的配制

注意：如果进行后续的RNA测序，需使用RNase去污染溶液彻底处理所有工作区域和工具，以防止mRNA降解。

1. 配制裂解缓冲液。
   1. 将以下成分溶于蒸馏水（H₂O）中，定容至 50 mL：5.47 g 蔗糖（终浓度 0.32 M）、250 µL 1 M 氯化钙（CaCl₂）（终浓度 5 mM）、150 µL 1 M 醋酸镁（Mg(CH₃COO)₂）（终浓度 3 mM）、10 µL 500 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）（终浓度 0.1 mM）、500 µL 1 M 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）（pH 8）（终浓度 10 mM）、50 µL Triton X-100（终浓度 0.1%）以及 17 µL 3 M 二硫苏糖醇（DTT，终浓度 1 mM，现用现加）（参见材料表）。
2. 配制蔗糖缓冲液
   1. 将以下成分溶于蒸馏水（H₂O）中，定容至 50 mL：30.78 g 蔗糖（终浓度 1.8 M）、150 µL 1 M 醋酸镁（Mg(CH₃COO)₂）（终浓度 3 mM）、500 µL 1 M Tris-HCl（pH 8）（终浓度 10 mM）以及 17 µL 3 M DTT（终浓度 1 mM，现用现加）。

2. 冷冻组织解离为单核悬液

1. 向一个7 mL的玻璃组织匀浆器（研磨器）中加入4 mL预冷的裂解缓冲液，并置于冰上。解剖约200–400 mg新鲜冷冻的人类成年大脑皮层组织，匀浆约50次，然后将组织匀浆液转移至一个12 mL的超速离心聚丙烯管中。
2. 使用5 mL移液器，将6.5 mL预冷的蔗糖缓冲液缓慢加入超速离心管底部，注意不要扰动蔗糖与组织匀浆液之间的界面。
   ​注意：若同时处理多个样本，需通过向较轻的样本中添加额外的裂解缓冲液，以重量精确平衡各离心管。超速离心管的精确平衡至关重要，以防止转子损坏并确保达到正确的转速。

3. 超速离心

1. 在 4 °C 条件下，以 24,400 rpm（101,814 × g）超速离心裂解物 1 小时。小心吸除上清液和碎片，避免扰动沉淀。
   注意：若起始组织量少于 200 mg，可能无法观察到沉淀。
2. 向细胞核沉淀中加入 600 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）（无钙（Ca²⁺）、无镁（Mg²⁺）），冰上孵育 10 分钟后再进行重悬。
3. 在冰上反复吹打 50 次，以重悬细胞核沉淀。
4. 使用血细胞计数板在显微镜下观察完整细胞核，并确保重悬液浓度高于 10⁵ 个细胞核/mL 后再进行下一步操作（取 10 µL 重悬的细胞核与 10 µL 台盼蓝混合）。

4. 抗体孵育

1. 为进行荧光激活细胞核分选（FANS）的免疫标记，向500 µL重悬的样品沉淀中加入490 µL 1× PBS（无Ca²⁺、Mg²⁺）、10 µL 10%牛血清白蛋白（BSA）（终浓度0.1%）、1 µL与AF（Alexa Fluor）555偶联的小鼠抗NeuN抗体（NeuN-AF555，终浓度1:1000）以及1 µL与别藻蓝蛋白（APC）偶联的小鼠抗PAX6抗体（PAX6-APC，终浓度1:1000）。
   注意：可选用与其他荧光染料偶联的替代抗体。此处使用了与AF488偶联的小鼠抗OLIG2抗体（1:1000浓度），结果良好。
2. 使用少量样品进行仅DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）和单色对照实验，以设定门控参数。
   1. 进行AF555单色对照时，向20 µL重悬的样品沉淀中加入970 µL 1× PBS（无Ca²⁺、Mg²⁺）、10 µL 10% BSA（终浓度0.1%）以及1 µL NeuN-AF555抗体（1:1000浓度）。
   2. 进行APC单色对照时，向20 µL重悬的样品沉淀中加入970 µL 1× PBS（无Ca²⁺、Mg²⁺）、10 µL 10% BSA（终浓度0.1%）以及1 µL PAX6-APC抗体（1:1000浓度）。
   3. 进行仅DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）对照时，向20 µL重悬的样品沉淀中加入970 µL 1× PBS（无Ca²⁺、Mg²⁺）和10 µL 10% BSA（终浓度0.1%）（DAPI将在后续步骤中添加，见4.4）。
      注意：若使用两种以上抗体，除单色对照外，建议同时进行减去一荧光（FMO）对照。
3. 将样品及对照在4 °C避光、旋转孵育1小时。
4. 向所有样品和对照中加入DAPI至1:1000稀释度，随后进行分选。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x PBS pH 7.2	Invitrogen	70013073
抗 NeuN 抗体克隆 A60	Millipore	MAB377A5MI	与荧光化合物 AF555 偶联的小鼠抗 NeuN 抗体（激发波长 553 nm；发射波长 568 nm）
抗 OLIG2 抗体克隆 211	Millipore	MABN50A4MI	与荧光化合物 AF488 偶联的小鼠抗 OLIG2 抗体（激发波长 499 nm；发射波长 520 nm）
牛血清白蛋白	Fisher	BP9704-100
亮线计数板	Hausser Scientific	3110V
无水氯化钙	Fisher	C614-3
细胞筛网，40 µM	SP Scienceware	136800040
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）	Invitrogen	D1306
邓氏组织研磨器	WHEATON	357542
FACS 分选仪	BD Biosciences		BD FACSAria III
四水合乙酸镁	Fisher	M13-500
PAX6（PAX6/496）— 100 次检测	Novus	NBP234705J
蔗糖，晶体级，ACS 级，500 mg	Fisher	S5500
SW 41 Ti 摆动桶转子	Beckman Coulter	331362
Tris-HCl，1M 溶液，pH 8.0，分子生物学级，超纯	Thermo Scientific	J22638AE
TritonX-100	Fisher	BP151-500	裂解缓冲液中的非离子型表面活性剂
台盼蓝溶液，0.4%	Gibco	15250061
超速离心机	Beckman Coulter Optima XE-100	A94516
超速离心管 PP 9/16 × 3-1/2	Beckman Coulter	331372
超纯蒸馏水（无 RNase、DNase）	Invitrogen	10977023	简称蒸馏水
超纯 EDTA	Life Technologies	15576-028