使用荧光激活细胞核分选从脑组织中分离细胞群

摘要

来源:Mussa， Z. 等人。使用荧光激活细胞核分选从新鲜冷冻的皮层中分离成年人星形胶质细胞群。J. Vis. Exp.（2021 年）

该视频演示了使用荧光激活细胞核分选 （FANS） 从新鲜冷冻的人脑组织中分离和分选细胞核的程序，从而能够研究不同细胞群以用于各种神经学应用。

方案

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 缓冲区准备

注意:如果进行下游 RNA 测序，请使用 RNase 去污溶液彻底处理所有工作区和工具，以防止 mRNA 降解。

1. 准备裂解缓冲液。
   将
   1. 以下物质溶于最多 50 mL 的蒸馏水 （H₂O） 中:5.47 g 蔗糖（0.32 M 终浓度），250 μL 1 M 氯化钙 （CaCl₂）（5 mM 终浓度），150 μL 1 M 乙酸镁 （Mg（CH₃COO）₂）（3 mM 终浓度），10 μL 500 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA）（0.1 mM 终浓度）， 500 μL 1 M Tris-盐酸 （Tris-HCl）（pH 值 8）（最终浓度为 10 mM），50 μL Triton X-100（最终浓度为 0.1%）和 17 μL 3 M 二硫苏糖醇（DTT，最终浓度为 1 mM，新鲜添加）（参见材料表）。
2. 制备蔗糖缓冲液
   1. 将以下物质溶于蒸馏的 H₂O 中至 50 mL:30.78 g 蔗糖（最终浓度为 1.8 M），150 μL 1 M Mg（CH₃COO）₂（最终浓度为 3 mM），500 μL 1 M Tris-HCl（pH 8）（终浓度为 10 mM），17 μL 3 M DTT（最终浓度为 1 mM，添加新鲜）。

2. 冰冻组织解离成单核悬液

1. 将 4 mL 冰冷的裂解缓冲液添加到 7 mL 玻璃组织研磨器（研磨机）中，并保持在冰上。解剖大约 200-400 mg 新鲜冷冻的人类成人皮层，大约 50 倍，然后将组织匀浆转移到 12 mL 超速离心聚丙烯管中。
2. 使用 5 mL 移液器，将 6.5 mL 冰冷的蔗糖缓冲液添加到超速离心管底部，注意不要干扰蔗糖和组织匀浆之间的层><。 注:如果处理其他样品，请向较轻的样品中添加额外的裂解缓冲液，按重量小心平衡试管。超速离心管的精确平衡对于防止损坏转子和确保以适当的速度旋转至关重要。

3. 超速离心

在
1. 4 °C 下以 24,400 rpm （101,814 × g） 超速离心裂解物 1 小时。小心吸出上清液和碎片，不要干扰沉淀。
   注意:如果从少于 200 毫克的组织开始，则可能看不到颗粒。
2. 向细胞核沉淀中加入 600 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）（不含钙 （Ca²⁺）、镁 （Mg²⁺）），并在冰上孵育 10 分钟，然后重悬。
3. 上下移液 50 次，将细胞核沉淀重悬于冰上。
4. 使用血细胞计数器在显微镜下观察完整的细胞核，并确保再悬液的浓度高于 10⁵ 个细胞核/mL，然后再进行下一步（将 10 μL 重悬的细胞核与 10 μL 台盼蓝混合）。

4. 抗体孵育

1. 为了对样品进行免疫标记以进行荧光激活细胞核分选 （FANS），加入 500 μL 重悬的样品沉淀、490 μL 1x PBS（Ca²⁺、Mg²⁺ free）、10 μL 10% 牛血清白蛋白 （BSA）（0.1% 终浓度）、1 μL 与 AF（Alexa fluor）555 偶联的小鼠抗 NeuN 抗体（NeuN-AF555,1:1000 终浓度）， 和 1 μL 与别藻蓝蛋白偶联的小鼠抗 PAX6 抗体（PAX6-APC，终浓度为 1:1000）
   注意:可以添加与其他荧光基团偶联的替代抗体。在这里，使用与 AF488 （1:1000 浓度） 偶联的小鼠抗 OLIG2 并取得了良好的结果。
2. 执行仅 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 和单色对照以设置门控参数，必要时使用少量样品。
   1. 要进行 AF555 单色对照，请添加 20 μL 重悬样品沉淀、970 μL 1x PBS（不含 Ca²⁺、Mg²⁺）、10 μL 10% BSA（最终浓度为 0.1%）和 1 μL NeuN-AF555 抗体（浓度为 1:1000
   ）。
   2. 要进行 APC 单色对照，添加 20 μL 重悬样品沉淀、970 μL 1X PBS（不含 Ca²⁺、Mg²⁺）、10 μL 10% BSA（最终浓度为 0.1%）和 1 μL PAX6-APC 抗体（浓度为 1:1000
   ）。
   3. 要进行仅 DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）对照，请添加 20 μL 重悬样品沉淀、970 μL 1X PBS（不含 Ca²⁺、Mg²⁺）和 10 μL 10% BSA（终浓度为 0.1%）（稍后将添加 DAPI，参见 4.4><）。 注意:如果使用两种以上的抗体，除了单色对照外，还建议进行荧光减一 （FMO） 对照。
3. 将样品和对照在黑暗中在 4 °C 下旋转孵育 1 小时。
4. 以 1:1000 的比例将 DAPI 添加到所有样品和对照中，然后继续排序。

材料