从大鼠海马体获取不同神经细胞群体

摘要

来源：Schwarz, J. M. 利用荧光激活细胞分选技术分析大鼠脑组织中细胞类型特异性基因表达。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了一种从大鼠海马组织中分离细胞的实验方案，包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 组织采集

1. 通过将β-巯基乙醇加入Buffer X中，配制Neural Dissociation Kit中的Buffer X，使其终浓度为0.067 mM（对于4个样本，将13.5 µl的50 mM β-巯基乙醇加入10 ml的Buffer X中）。
2. 按照Neural Dissociation Kit的操作说明，为每个样本将50 µl的Enzyme P与1,900 µl的Buffer X混合，配制Enzyme Mix 1。例如，对于4个样本，将200 µl的Enzyme P与7,600 µl的Buffer X混合。
3. 将Buffer X置于37 ºC水浴中预热。
4. 为每个待收集的样本，在无菌6孔培养板的一个孔中加入2 ml冰冷的不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的Hank's平衡盐溶液（HBSS），并将培养板置于冰上，用于组织解离。

2. 神经组织解离（1 小时）

1. 使用无菌剃刀片在6孔培养板的盖子上将每份组织样本切成小块。本方案适用于约30–100 mg的组织样本，但也可用于最大达400 mg的组织样本。对于超过400 mg的组织样本，需按比例增加试剂体积。
2. 用1 ml不含Ca²⁺和Mg²⁺的新鲜HBSS，通过移液器将切碎的组织块转移至无菌的2 ml离心管中。对所有样本重复步骤2.1和2.2，直至所有样本均转移至2 ml离心管中。
3. 在室温下以300 × g离心2分钟，并吸除上清液。
4. 向每个样本中加入1,900 µl按步骤1.2和1.3配制的预热酶混合液1，并盖紧管盖。
5. 将样本置于37 ºC水浴中孵育15分钟，每隔5分钟轻轻倒置管子数次，以重新悬浮沉降的组织块。
6. 同时，通过将20 µl缓冲液Y与10 µl解冻的酶A混合来配制酶混合液2（对于4个样本，将80 µl缓冲液Y与40 µl解冻的酶A混合）。
7. 向每个样本中加入30 µl酶混合液2，并轻轻倒置混匀。切勿涡旋震荡。
8. 使用Pasteur移液管“1”对每份组织样本进行解离，上下吹打30次。
9. 将样本在37 ºC水浴中继续孵育15分钟，每隔5分钟倒置管子数次，以重新悬浮沉降的组织块。
10. 使用Pasteur移液管“2”对每份组织样本进行解离，上下吹打30次，避免产生气泡。
11. 使用Pasteur移液管“3”对每份组织样本进行解离，上下吹打30次，避免产生气泡。
12. 将样本在37 ºC水浴中孵育10分钟，每隔5分钟倒置管子数次，以重新悬浮沉降的细胞。
13. 将单细胞悬液通过置于15 ml Falcon管顶部的80微米细胞滤网过滤，以去除任何大块碎片，并用10 ml含Ca²⁺和Mg²⁺的HBSS冲洗滤网和细胞，以终止酶反应。重复操作，直至每个样本均转移至洁净的15 ml Falcon管中。
14. 在室温下以300 × g离心10分钟，并吸除上清液。

3. 髓鞘耗竭（45 分钟）

1. 用400 µl髓鞘去除缓冲液充分重悬细胞沉淀。
2. 加入指定量的髓鞘去除磁珠，用移液器上下吹打充分混匀。
   注意： 髓鞘去除磁珠的使用体积取决于组织大小、动物年龄以及特定脑区预期的髓鞘含量。例如, 对于一个成年大鼠海马组织样本（约300 mg），将样本与100 µl 髓鞘去除磁珠共同孵育。
3. 在4 ºC冰箱中孵育15分钟。
4. 用 5 ml 髓鞘去除缓冲液洗涤每个样品。
5. 在室温下以 300 x g 离心 10 分钟。
6. 在离心样品的同时，将每个样品对应的1根色谱柱置于磁力分选器的磁场中，并在每根色谱柱顶部放置一个洁净的80微米滤器。
7. 准备柱子和滤器，用1 ml去髓鞘缓冲液冲洗每根柱子3次（共3 ml）。将所有流出液收集至废液容器中，例如空枪头盒的底部。
8. 将一个5 ml聚苯乙烯圆底管置于每根层析柱正下方，以准备收集样品。
9. 细胞完成离心后，吸除上清液，并在500 µl髓鞘去除缓冲液中充分重悬。立即将细胞悬液加入柱中，并收集柱下流出管中的细胞。
10. 用1 ml髓鞘去除缓冲液洗涤滤器和柱子，重复4次（共4 ml）。
11. 在室温下以 300 x g 离心收集细胞 10 分钟。
12. 吸去上清液，细胞即可用于染色。

4. 活细胞染色用于流式细胞分选（染色耗时1小时）

1. 短暂涡旋振荡细胞（2秒）以重悬沉淀，立即加入5 µl Fc阻断剂（抗分化簇32，CD32），再次涡旋振荡，于4 ºC冰箱中孵育5分钟。
2. 同时，配制一抗混合液：每100 µl洗涤缓冲液中加入以下三种一抗，分别为：0.125 µl别藻蓝蛋白（APC）标记的CD11b抗体（1:800）、1 µl抗GLT1抗体（1:100）以及0.4 µl异硫氰酸荧光素（FITC）标记的Thy1抗体（1:250）。每个样本将加入100 µl一抗混合液进行孵育；但如果样本组织量远超过400 mg，则应相应增加一抗混合液的体积
3. 为单染对照准备离心管，从每个样本管中各取出 2 µl 细胞，分别加入各单染对照管中。“单染”对照包括：仅 APC-CD11b、仅 GLT1、仅 FITC-Thy1、仅 PE 二抗，以及“空白”或未染色对照。
   注意： 所有样本均应出现在每种染色对照中，因此应向每个染色对照管中加入来自每个样本的 2 µl 细胞。
4. 短暂涡旋振荡各管（2秒），向每个样本管中加入100 µl一抗混合液，向每个染色对照管中加入100 µl相应的一抗，再次涡旋振荡各管，用铝箔包裹管子以避光保护荧光抗体，并将管子置于4 ºC冰箱中孵育20分钟。后续操作过程中应始终保持样品处于低温（4 ºC），以维持样品和抗体的完整性。
5. 短暂涡旋振荡各管，然后向每管中加入2 ml洗涤缓冲液。
6. 在 4 ºC 条件下，以 350 x g 离心 5 分钟。
7. 同时，通过在每100 µl洗涤缓冲液中加入0.2 µl PE标记的抗兔二抗来配制二抗混合液。每个样本将加入100 µl二抗混合液；然而，如果您的样本组织量远超过400 mg，则可能需要相应增加一抗混合液的体积。
8. 离心结束后，将每个样品的上清液倒入水槽，并将离心管倒置在纸巾上吸干。
9. 轻轻涡旋混匀各管，向每个样本管中加入100 µl二抗混合液，并向各染色对照管中加入相应的二抗。再次涡旋混匀各管，用铝箔纸包裹，于4ºC冰箱中避光孵育15分钟。
   注意： 仅含GLT1的染色对照管应加入二抗混合液。
10. 孵育后，短暂涡旋振荡各管，然后向每管中加入2 ml洗涤缓冲液。
11. 在 4ºC 条件下，以 350 x g 离心 5 分钟。
12. 离心完成后，将每个样品的上清液倒入水槽，并将离心管倒置在纸巾上吸去残留液体。
13. 涡旋混匀各管，并向每管中加入0.25 ml无菌PBS。样品即可用于分选。
    注意： 细胞较多时可能需要0.5 ml无菌PBS；但最好先使用较低体积，因为如果细胞浓度过高，后续可随时稀释样本。
    注意： 可选择性地向管中加入DNase，以防止细胞聚集，从而避免堵塞分选仪。分选前也可使用无菌的80微米滤膜过滤样品，以防止堵塞分选仪。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
神经组织解离试剂盒（P型）	Miltenyi Biotec	130-092-628
髓鞘去除磁珠II	Miltenyi Biotec	130-096-733
LS型分离柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACS细胞分选器	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACS多联支架	Miltenyi Biotec	130-042-303
尼龙筛网片	Amazon	CMN-0074-10YD	宽度40英寸，孔径80微米
Fc阻断剂 / 抗CD32抗体	BD Biosciences	BDB550270	适用于大鼠
APC标记的CD11b抗体	Biolegend	201809	适用于大鼠
兔抗GLT1抗体	Novus Biologicals	NBP1-20136	适用于大鼠或人
PE标记的抗兔二抗	eBioscience	1037259	用于抗GLT1抗体的二抗
FITC标记的抗大鼠CD90（Thy1）小鼠抗体	Biolegend	202504	适用于大鼠