来源：Germany, E. M.，等。从线虫Caenorhabditis elegans中分离特定神经元群体。J. Vis. Exp. (2019)
本视频展示了从秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中分离荧光标记神经元的方法。通过转基因线虫制备细胞悬液，这些线虫的胆碱能神经元中表达有荧光蛋白融合的囊泡跨膜转运蛋白。随后利用荧光激活细胞分选（FACS）分离出荧光标记的神经元，并进行体外培养。
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方法文章
通过荧光激活细胞分选法从秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中分离神经元
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 用于细胞分离的衰老线虫的准备与收集
- 收集线虫并制备细胞分离用缓冲液。
- 收集线虫至15 mL锥形管中，用1.5 mL M9缓冲液（1 mM MgSO₄）从平板上冲洗线虫4，85 mM NaCl，42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4，pH 7.0）中，1,600 × g 离心 5 分钟 g弃去上清液，用1 mL M9缓冲液洗涤线虫。重复离心和洗涤，共进行五次，以尽可能去除 大肠杆菌 尽可能减少污染。
注意： 在此步骤中加入抗生素（如氨苄青霉素，50 µg/mL）有助于减少细菌污染。 - 对于两个样品，配制 2 mL 十二烷基硫酸钠-二硫苏糖醇（SDS-DTT）裂解缓冲液：含 200 mM DTT、0.25% (w/v) SDS、20 mM HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）（pH 8.0）和 3% (w/v) 蔗糖。
- 配制 15 mL 分离缓冲液（118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 10 mM HEPES, 5 mM 葡萄糖，pH 7.4）2，2 mM MgCl2，25 mM HEPES [pH 7.3]）并置于冰上保存。
注意： SDS-DTT 裂解缓冲液和分离缓冲液均需在每次实验前新鲜配制。
- 收集线虫至15 mL锥形管中，用1.5 mL M9缓冲液（1 mM MgSO₄）从平板上冲洗线虫4，85 mM NaCl，42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4，pH 7.0）中，1,600 × g 离心 5 分钟 g弃去上清液，用1 mL M9缓冲液洗涤线虫。重复离心和洗涤，共进行五次，以尽可能去除 大肠杆菌 尽可能减少污染。
- 角质层破坏与单细胞分离
- 离心步骤 1.1.1 中收集的动物样品，1,600 x g，5 分钟 g去除所有上清液，将线虫重悬于1 mL M9培养基中，并转移至1.5 mL微量离心管中。
- 以1,600 x g离心收集线虫沉淀 g 5 分钟。
- 向线虫中加入 200 µL SDS-DTT 裂解缓冲液，在室温（RT）下孵育 5 分钟。若在光学显微镜下观察，线虫体表应呈现“皱缩”状。
注意： 长时间暴露于SDS-DTT裂解缓冲液可能导致线虫死亡，可通过观察线虫状态进行监测。死亡的线虫会伸长且不再卷曲。 - 加入800 µL预冷的分离缓冲液，轻轻弹击离心管混匀。
- 以13,000 x g离心蠕虫1分钟 g 在 4 °C 下，移除上清液，并用 1 mL 裂解缓冲液洗涤。
- 重复步骤 1.3.5，共进行五次，每次均需小心移除分离缓冲液。
- 加入100 µL蛋白酶混合液 Streptomyces griseus (15 mg/mL) (材料表) 加入溶于分离缓冲液的溶液至沉淀中，室温下孵育10−15分钟。
注意： 与SDS-DTT裂解缓冲液类似，延长蛋白酶消化时间可能导致细胞膜蛋白过度切割，从而阻碍通过磁珠分离细胞表面暴露的绿色荧光蛋白（GFP）。 - 孵育蛋白酶混合物期间，使用200 µL移液枪头在1.5 mL微量离心管底部反复吹打样本约60−70次，以实现机械性解离。保持移液枪头紧贴微量离心管管壁并施加恒定压力，以充分解离细胞。
- 为确定消化程度，取少量消化混合液（约1−5 µL），滴于玻璃载片上，使用组织培养显微镜观察。孵育5−7分钟后，可见虫体碎片的角质层明显减少，并可清晰观察到细胞悬液。
- 用900 μL市售的冷Leibovitz's L-15培养基终止反应，该培养基添加有10%胎牛血清（FBS）以及青霉素-链霉素溶液（终浓度为50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素）。
- 离心10,000 x，5分钟，收集沉淀的碎片和细胞 g 在 4 °C 下，用 1 mL 冷的 L-15 补充培养基再清洗沉淀细胞两次，以确保去除多余的碎片和角质层。
- 将沉淀的细胞重悬于1 mL含L-15补充剂的培养基中，冰上静置30分钟。取上层约700−800 µL转移至微量离心管中。此层含有无细胞碎片的细胞，将用于后续目标细胞的分离。
- 根据制造商说明，使用自动细胞计数器或血细胞计数板对 10−25 µL 分离细胞进行细胞密度测定。
2. 通过流式细胞术分离GFP阳性细胞
- 通过流式细胞术分离GFP阳性细胞
- 从步骤1.2.12中收集的分离细胞悬液中，以10,000 x g 在4 °C下离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀的细胞重悬于补充培养基L-15中，细胞密度不超过6 x 106 个细胞/mL，以避免流式细胞仪过载。
- 使用具备分选功能的流式细胞仪，根据GFP阳性表达对细胞进行分选。GFP阴性细胞可用于非特定细胞类型的分析对照。
- 分离细胞的培养
- 将分离的细胞接种至无菌的6孔多孔板中。
注意：这些孔板可用花生凝集素包被以增强细胞贴附；但如果细胞将立即使用，则可省略此步骤。 - 将孔板放入塑料容器中，在20 °C下孵育，并用湿润的擦拭布或软纸巾（在双蒸水[ddH2O]中加入50 µg/mL氨苄青霉素，以防止擦拭物上细菌生长）提供湿度。切勿在CO2 培养箱中孵育，因为升高的CO2 水平可能损伤细胞。
- 将分离的细胞接种至无菌的6孔多孔板中。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6 孔板 | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| 琼脂，分子生物学级 | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Contess 自动细胞计数仪 | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes 纸巾 | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 培养基 | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl（漂白剂） | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| 青霉素-链霉素 | Fisher Scientific | 15140122 | |
| 蛋白胨 Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | 来自灰色链霉菌的蛋白酶混合物 |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC 荧光体视显微镜 | Tritech Research | ||
| 蔗糖 | USBiological | S8010 |
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