从胚胎雏鸡脑中获取小脑切片

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 鸡胚胎解剖第 14 天 （e14） 小脑

1. 将棕色受精母鸡的鸡蛋在 38 °C 下孵化至胚胎第 14 天。
2. 使用鸡蛋剪刀，将卵中的雏鸡胚胎斩首，然后将头部移到含有冰冷的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的培养皿中（图 1A）。
3. 使用标准镊子，在每只眼睛后面一直穿过组织切开，去除眼睛和上颌。在咽部做第二个切口，去除下颌（图 1B）。
4. 使用标准镊子，通过剥开颅骨表面去除所有皮肤（图 1C），并去除额骨和顶骨，露出大脑。
5. 从腹侧，去除咽软骨和辅助间充质。
6. 从背侧，小心地去除后脑背侧的间充质，注意不要损坏软脑膜，并将整个大脑分开（图 1D）。
在
7. 中脑和后脑之间的组织中做一个切口，并分离后脑，包括小脑（图 1E）。
8. 通过在小脑和后脑鼻翼板的两个外侧交界处切开组织，去除整个小脑，注意在整个解剖过程中保持软脑膜的完整性（图 1F）。此外，去除正在形成的脉络丛（图 1G）。
9. 将解剖的小脑移入冰冷的 Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 中。

2. e14 小脑切片培养

1. 使用抹刀或 3 ml 巴斯德移液管将整个小脑转移到组织切碎机的无菌平台上，并切掉尖端以扩大孔径。使用移液管去除多余的液体。
2. 使用组织切碎器组以 300 μm 的厚度以所需的方向切割整个小脑，切割速度为最大速度的 50%。矢状面的组织完整性最容易保持;然而，方向也是细胞分析的一个重要考虑因素（浦肯野细胞树突矢状排列，而颗粒细胞轴突横向延伸，垂直于浦肯野细胞树突的平面）。
3. 使用 3 ml 巴斯德移液管，将切片的小脑覆盖在冰冷的 HBSS 中。
4. 使用带有切割尖端的 3 ml 巴斯德移液管，将 HBSS 中的切片转移到含有冰冷新鲜 HBSS 的 60 mm 培养皿中。
5. 在用光纤光源照射的解剖显微镜下，确保使用制表镊子分离单个切片。
   注意:每次解剖，从胚胎到在培养基中孵育切片，大约需要 10-20 分钟，具体取决于经验。一次进行一个解剖，以确保小脑在斩首和离体培养之间花费最少的时间。

图 1.从 E14 雏鸡胚胎中解剖小脑。（A） 将鸡蛋中的雏鸡斩首，将头取出，放入装有冰冷 PBS 的培养皿中。通过在眼睛和咽部后面做一个切口（虚线）来去除下颌和眼睛。（B） 去除颅骨表面的皮肤。（C） 去除额骨和顶骨，以及 （D） 从其周围的间充质和软骨中取出大脑。（E） 在解剖显微镜下，确定小脑在大脑后端的位置。在中脑和后脑之间切开（虚线），留下小脑和腹侧后脑。（F） 在小脑的外侧交界处（花梗）做切口，将小脑与后脑分开（虚线）。（G） 从小脑腹侧去除脉络丛（星号），直到留下一个完整的小脑并附有软脑膜。将小脑转移到冰冷的 HBSS 中，然后用组织切碎机准备切片。