获取鸡胚脑小脑切片

摘要

来源：Hanzel, M., 等 离体 鸡胚小脑切片培养及颗粒细胞前体的靶向电穿孔转染 J. Vis. Exp. (2015).

该视频展示了小脑切片的制备过程。详细演示了从小鸡胚胎中分离小脑的操作步骤。随后，利用组织切片机对解剖所得的小脑进行切片，以用于后续实验分析。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 鸡胚第14天（e14）小脑的解剖

1. 将受精的褐色鸡蛋在38 °C条件下孵育至胚胎第14天。
2. 使用卵剪将鸡胚去头 在卵内 并将头部移至含有冰冷磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中图1A).
3. 使用标准镊子，在每只眼睛后方穿过组织做切口，摘除眼睛和上颌。再做第二个切口，完全穿过咽部，摘除下颌。图1B).
4. 使用标准镊子，通过剥离的方式将颅骨表面的所有皮肤完全去除（图1C) 并去除额骨和顶骨，暴露脑组织。
5. 从腹侧去除咽部软骨及附属间充质。
6. 从背侧小心去除后脑背侧的间充质，注意不要损伤软脑膜，并分离出整个脑组织图1D).
7. 在中脑与后脑之间沿组织做一切口，彻底切断，并分离后脑部分，包括小脑图 1E).
8. 通过在小脑与后脑翼板两侧连接处完全切穿组织，完整移除小脑，注意在整个解剖过程中保持软脑膜的完整性（图1F）。同时，移除正在形成的脉络丛（图1G).
9. 将解剖出的小脑移入冰冻的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中。

e14 小脑的切片培养

1. 使用刮勺或剪去尖端以扩大开口的 3 ml 巴斯德吸管，将整个小脑转移至组织切片机的无菌平台上。用移液器去除多余液体。
2. 使用组织切片机以最大速度的 50% 切割速度，按所需方向将整个小脑切成 300 µm 厚的切片。小脑组织在矢状面切片时最易保持结构完整性；然而，切片方向对于细胞分析也至关重要（浦肯野细胞的树突沿矢状方向排列，而颗粒细胞的轴突则横向走行，垂直于浦肯野细胞树突所在的平面）。
3. 使用 3 ml 巴斯德吸管，用冰冻的 HBSS 覆盖切好的小脑组织。
4. 使用剪去尖端的 3 ml 巴斯德吸管，将 HBSS 中的脑片转移至含有冰冻新鲜 HBSS 的 60 mm 培养皿中。
5. 在光纤光源照明的解剖显微镜下，使用钟表匠镊子确保各个切片彼此分离。
   注意： 每次解剖操作，从胚胎取材到脑片接种入培养基中，大约需要 10–20 分钟，具体时间取决于操作者的熟练程度。应逐个进行解剖操作，以确保小脑组织从离体到体外培养之间的时间最短。

结果

图1. 从E14鸡胚中解剖小脑。（A）在蛋内将鸡胚头部切断，并将其头部分离至含有冰冻PBS的培养皿中。通过在眼睛后方和咽部（虚线）处做切口，移除下颌和眼球。（B）去除颅骨表面的皮肤。（C）移除额骨和顶骨，（D）从小脑周围间充质和软骨组织中取出脑组织。（E）在解剖显微镜下识别小脑位于脑后端的位置。在中脑与后脑之间做切口（虚线），保留小脑及腹侧后脑部分。（F）在小脑的侧连接处（小脑脚）做切口，将小脑与后脑分离（虚线）。（G）从小脑腹侧去除脉络丛（星号），直至获得带有软脑膜附着的完整且未受损的小脑。将小脑转移至冰冻HBSS中，随后使用组织切片机进行切片制备。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
McIlwain 组织切片机	Mickle Laboratory Engineering Ltd		切割厚度为 300μm 时效果最佳。