建立源自小鼠脊髓的原代混合胶质细胞培养

摘要

来源：Malon, J. T.，等。成年小鼠脊髓组织原代混合胶质细胞培养物的制备。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了一种从成年小鼠脊髓组织中分离和培养原代混合胶质细胞的技术。该方案包括对组织进行酶消化，随后去除破碎的细胞膜和髓鞘碎片，以获得单细胞悬液。然后将细胞接种于适合混合胶质细胞生长的优化培养基中进行培养。

方案

1. 在无菌条件下于细胞培养罩内配制溶液

1. 配制培养基：完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（cDMEM），包含DMEM（含4.5 g/L葡萄糖）、10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素、100 mg/mL链霉素、250 ng/mL两性霉素B和50 µM 2-巯基乙醇（2-ME；见1.1.1）。将除FBS外的所有其他组分混合并过滤除菌，然后加入FBS。将培养基在4℃保存 ^°C.
   1. 制备50 mM 2-巯基乙醇（2-ME）/磷酸盐缓冲液（PBS）储备液：将100 µL浓2-ME（14.3 M）加入28.6 mL 1× PBS中，过滤除菌（该溶液可在4℃保存） ^°C 可保存数月）。每 1,000 mL 培养基使用 1 mL 2-ME 储存液。
2. 密度梯度介质的制备
   1. 制备储备等渗密度梯度介质溶液（例如， 100% Percoll）由1份10倍浓度的无菌PBS与9份无菌储存密度梯度介质混合而成（例如， Percoll
   2. 将1.2.1中制备的100%密度梯度介质用常规1×无菌PBS稀释，配制成20%密度梯度介质（例如， 10 mL 100% 密度梯度介质与 40 mL 1× PBS 混....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含 4.5 g/L 葡萄糖的 Eagle 培养基的杜尔贝科改良版（DMEM）	Lonza	12-709F	cDMEM 培养基是一种标准且广泛使用的培养基。  研究人员可自行决定 DMEM 及用于配制 cDMEM 培养基的所有其他组分的购买来源。
L-谷氨酰胺（100 倍浓缩液）	Lonza	17-605E	L-谷氨酰胺是多种培养基中常用的标准组分。研究人员可自行决定 L-谷氨酰胺的购买来源。
抗生素-抗真菌素溶液（100 倍浓缩液）	Corning-Mediatech	30-004-CI	该溶液为青霉素、链霉素和两性霉素 B 的混合物，配方包含 10,000 单位/mL 青霉素 G、10 mg/mL 硫酸链霉素和 25 µg/mL 两性霉素 B。研究人员可自行决定各组分的购买来源。
2-巯基乙醇（2-ME）	Sigma-Aldrich	M3148	一种生物试剂，适用于细胞培养、分子生物学和电泳。
木瓜蛋白酶解离系统	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	该试剂盒的各个组分可单独购买。
Percoll	GE Health Care	17-0891-01	Percoll 以无菌溶液形式出售。如需，未稀释的 Percoll 可重新进行高压灭菌。
Lab-line 培养箱/摇床	Barstead/Lab-line	MaxQ4000	这是我们目前使用的培养箱/摇床。也可使用其他类型的摇床。