建立源自小鼠脊髓的原代混合胶质细胞培养

摘要

来源：Malon, J. T.，等。成年小鼠脊髓组织原代混合胶质细胞培养物的制备。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了一种从成年小鼠脊髓组织中分离和培养原代混合胶质细胞的技术。该方案包括对组织进行酶消化，随后去除破碎的细胞膜和髓鞘碎片，以获得单细胞悬液。然后将细胞接种于适合混合胶质细胞生长的优化培养基中进行培养。

方案

1. 在无菌条件下于细胞培养罩内配制溶液

1. 配制培养基：完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（cDMEM），包含DMEM（含4.5 g/L葡萄糖）、10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素、100 mg/mL链霉素、250 ng/mL两性霉素B和50 µM 2-巯基乙醇（2-ME；见1.1.1）。将除FBS外的所有其他组分混合并过滤除菌，然后加入FBS。将培养基在4℃保存 ^°C.
   1. 制备50 mM 2-巯基乙醇（2-ME）/磷酸盐缓冲液（PBS）储备液：将100 µL浓2-ME（14.3 M）加入28.6 mL 1× PBS中，过滤除菌（该溶液可在4℃保存） ^°C 可保存数月）。每 1,000 mL 培养基使用 1 mL 2-ME 储存液。
2. 密度梯度介质的制备
   1. 制备储备等渗密度梯度介质溶液（例如， 100% Percoll）由1份10倍浓度的无菌PBS与9份无菌储存密度梯度介质混合而成（例如， Percoll
   2. 将1.2.1中制备的100%密度梯度介质用常规1×无菌PBS稀释，配制成20%密度梯度介质（例如， 10 mL 100% 密度梯度介质与 40 mL 1× PBS 混合后，于 4 ℃ 保存 ^°C. 在准备细胞培养前，将20%密度梯度介质置于室温（RT）平衡。
3. 木瓜蛋白酶解离系统的溶液制备
   ​注意： 木瓜蛋白酶解离系统可在其中被识别 材料表其他类似的解离试剂盒（包括自行配制的试剂盒）也可使用。所有组分必须无菌。
   1. 向卵黏蛋白抑制剂混合物（粉末）中加入 32 mL 的 Earle 平衡盐溶液（EBSS）。
   2. 向一个木瓜蛋白酶小瓶（粉末）中加入 5 mL EBSS。将木瓜蛋白酶小瓶置于 37 ^°37°C 水浴中孵育 10 分钟，或直至木瓜蛋白酶完全溶解。
   3. 向一个DNase小瓶（粉末）中加入500 µL EBSS，轻轻混匀。
   4. 向木瓜蛋白酶小瓶中加入250 µL DNase溶液（上述）。
   5. 计算所需上述木瓜蛋白酶/DNase混合液的总量（每只小鼠脊髓约需800 µL），并将所需混合液转移至50 mL离心管中用于组织消化。剩余混合液保存在原瓶中，置于4 °C，可至少保存两周。
   6. 使用前将试剂盒中的所有组分置于冰上保存。
4. 准备脊髓收集管：一个无菌15 mL离心管中加入5 mL汉克斯平衡盐溶液（HBSS，来自木瓜蛋白酶解离系统，用于收集脊髓组织），另一个无菌15 mL离心管中加入1×PBS（用于填充5 mL注射器）。此外，准备一个无菌培养皿（35 mm或60 mm），加入5 mL HBSS，置于超净台中备用。

2. 单细胞悬液的制备

注意： 步骤 3 和 4 需在超净工作台中进行，以保持无菌环境。

1. 将所有脊髓组织转移至含有HBSS的培养皿中。使用无菌剪刀和镊子将每根脊髓切成许多细小的碎片。用无菌镊子或10 mL移液器将脊髓组织转移至含有预先配制的木瓜蛋白酶/DNase酶混合液的50 mL锥形管中（步骤1.3.5）（避免将HBSS加入酶混合液中，以免进一步稀释已配制的酶溶液，可能导致酶活性降低）。
2. 轻轻涡旋混匀管内液体。将管子置于37 ^oC的培养箱/摇床中，以150 rpm的转速振荡孵育1小时。
3. 再次涡旋管子，并使用5 mL移液器用力吹打含有组织的酶溶液，以促进进一步解离。
4. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在室温下以300 × g离心5分钟。
5. 在离心过程中，于无菌管中将2.7 mL EBSS与300 µL重悬的白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液（1.3.1）混合。加入150 µL DNase溶液（步骤1.3.3）。
6. 离心结束后，弃去上清液，并用上述步骤（1.5）中配制的溶液重悬细胞沉淀。充分涡旋以彻底分散细胞沉淀。
7. 向细胞悬液中加入3 mL重悬的白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液（步骤1.4.1）。在室温下以70 × g离心6分钟。弃去上清液（其中含有膜碎片）。

3. 从单细胞悬液中进一步去除髓鞘

1. 向含有细胞沉淀的离心管中加入 8 mL 20% 密度梯度介质（按步骤 1.2.2 制备），轻轻涡旋以充分分散沉淀，然后在室温下以 800 × g 离心 30 分钟，离心过程中禁止使用刹车。小心移除上层碎片（主要是髓鞘）和上清液，保留沉淀。
2. 为去除残留的密度梯度介质，用 8 mL 稀释的 cDMEM（1 份 cDMEM 与 2 份 HBSS 混合）重悬细胞沉淀进行洗涤。在 4 ^oC 下以 400 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，并用上述稀释的 cDMEM 以相同方式再次洗涤细胞。洗涤后将细胞置于冰上，直至接种。
3. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于培养基中（含 2-ME 的 cDMEM，按步骤 1.1 制备）。若用于一个 12 孔板，所需培养基体积为 3 mL × 4（使用的小鼠数量）+ 2 mL = 14 mL。该体积可确保整个 12 孔板（共 12 孔）有足够的细胞悬液，并额外提供若干孔用于测定每孔平均细胞数及培养物中小胶质细胞的比例。若使用其他类型的培养容器，请按比例计算所需培养基的总体积。
4. 将 1 mL 细胞悬液加入 12 孔板的每一孔中。
5. 将细胞置于 35.9 ^oC、5% CO₂ 条件下培养。
6. 在第 1 天更换培养基（通过抽吸去除旧培养基），之后每 3–4 天更换一次（通常在第 1、4、8 和 11 天更换培养基，并于第 12 天开始使用细胞）。
   注意： 第 1 天时，由于脊髓组织残留的髓鞘成分，培养物中可能存在较多碎片；因此建议在第 1 天更换培养基。细胞培养至第 12–14 天即可用于实验处理。通常在第 12 天时细胞融合度约为 80%，到第 14 天时可接近 100%。一般情况下，在第 12 天时，12 孔板每孔约有 100,000 个细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含 4.5 g/L 葡萄糖的 Eagle 培养基的杜尔贝科改良版（DMEM）	Lonza	12-709F	cDMEM 培养基是一种标准且广泛使用的培养基。  研究人员可自行决定 DMEM 及用于配制 cDMEM 培养基的所有其他组分的购买来源。
L-谷氨酰胺（100 倍浓缩液）	Lonza	17-605E	L-谷氨酰胺是多种培养基中常用的标准组分。研究人员可自行决定 L-谷氨酰胺的购买来源。
抗生素-抗真菌素溶液（100 倍浓缩液）	Corning-Mediatech	30-004-CI	该溶液为青霉素、链霉素和两性霉素 B 的混合物，配方包含 10,000 单位/mL 青霉素 G、10 mg/mL 硫酸链霉素和 25 µg/mL 两性霉素 B。研究人员可自行决定各组分的购买来源。
2-巯基乙醇（2-ME）	Sigma-Aldrich	M3148	一种生物试剂，适用于细胞培养、分子生物学和电泳。
木瓜蛋白酶解离系统	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	该试剂盒的各个组分可单独购买。
Percoll	GE Health Care	17-0891-01	Percoll 以无菌溶液形式出售。如需，未稀释的 Percoll 可重新进行高压灭菌。
Lab-line 培养箱/摇床	Barstead/Lab-line	MaxQ4000	这是我们目前使用的培养箱/摇床。也可使用其他类型的摇床。