将耳部祖细胞分化为感觉上皮细胞并进行免疫染色

摘要

来源：Azadeh, J. 等，在永生化多能耳源性祖细胞中启动分化 J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了永生化多能耳源性前体细胞（iMOP）向感觉上皮细胞的分化过程。内容概述了培养iMOP细胞、形成耳球体、诱导分化，以及通过荧光显微镜观察细胞组分和分化标志物以确认细胞成功分化的各个步骤。

方案

1. IMOP 细胞自我更新的维持

1. 制备iMOP培养基：DMEM/F12、1× B27添加剂、25 µg/ml羧苄西林和20 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。使用无菌试剂配制50 ml iMOP培养基。将49 ml DMEM/F12加入50 ml锥形管中，置于37 °C水浴中预热。
   1. 将50倍浓度的B27添加剂和经滤膜除菌的100 mg/ml羧苄西林分装液在37 °C水浴中解冻5分钟。在室温下解冻100 µg/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）分装液。向DMEM/F12培养基中加入1 ml 50倍浓度的B27添加剂、10 µl 100 µg/ml bFGF以及12.5 µl 100 mg/ml羧苄西林。
2. 在60 mm组织培养皿中使用3 ml培养基培养iMOP细胞。每隔一天通过加倍培养基体积的方式添加新鲜培养基。确保bFGF浓度不低于5 ng/ml。
   1. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 iMOP 细胞_2. 在培养5至7天后按以下步骤传代细胞。使用10 ml移液器吸头将培养物转移至15 ml锥形管中。
3. 将0.1 ml的0.5 M EDTA（pH 8.0）加入50 ml HBSS中，配制成1 mM EDTA溶液。将用HBSS配制的1 mM EDTA置于37 °C水浴中预热。
4. 通过重力沉降或在室温下以200 × g离心5分钟收集细胞。对于重力沉降，将含有培养物的15 ml锥形管置于37 °C培养箱中5–10分钟。此后，观察到耳球体聚集在15 ml锥形管底部。
   注意： 过高的离心力可能导致细胞损伤。
5. 使用2 ml吸液枪小心吸除废液，注意不要扰动细胞沉淀。向细胞沉淀中加入0.5 ml预热的1 mM EDTA HBSS溶液。用P1000移液器轻柔吹打2–3次。将离心管置于37 °C孵育 <5 分钟以促进解离为单细胞。
6. 轻轻摇动细胞悬液，观察耳球体是否已解离。若无耳球体沉降至锥形管底部，则表明细胞已解离。孵育时间可能有所差异。
   注意： 长时间孵育EDTA将导致细胞过度死亡。
7. 将细胞从37 °C取出，加入2 ml培养基以中和并稀释EDTA。在室温下以200 × g离心5 min收集细胞。使用2 ml移液器吸除稀释后的EDTA，并加入5 ml 1× PBS洗涤细胞。
8. 在室温下以200 x g离心5分钟，使用2 ml移液管吸除1X PBS。用P1000移液器在0.5 ml iMOP培养基中轻柔吹打2–3次，重悬细胞。
9. 使用配备合适卡盒的微流控粒子计数器对细胞进行计数。一个汇合的iMOP细胞培养板将含有约6 × 10⁶个细胞。⁶ 细胞。将细胞用培养基按1:100稀释，取75 µl细胞悬液加入计数板中进行计数。接种1 × 10⁶ 在6 cm培养皿中的iMOP培养基中培养细胞（约1:10稀释）。每5至7天传代一次iMOP细胞。
   注意： 形成较大耳球或贴壁于培养皿底部的细胞将发生分化。若培养细胞过度融合，也会导致细胞死亡。

2. 将 IMOP 细胞分化为感觉上皮

1. 制备 50 ml 的 iMOP 感觉上皮分化培养基：DMEM/F12，1× B27 补充剂，25 µg/ml 羧苄青霉素。配制 50 ml iMOP 感觉上皮分化培养基。将 49 ml DMEM/F12 倒入 50 ml 锥形离心管中，并在 37 °C 水浴中预热。将 50× B27 补充剂和 100 mg/ml 羧苄青霉素分装液在 37 °C 水浴中解冻 5 分钟。向 DMEM/F12 中加入 1 ml 50× B27 补充剂和 12.5 µl 100 mg/ml 羧苄青霉素。
2. 为收获、解离、重悬并计数细胞，请重复步骤 1.4–1.9
3. 在第 -3 天，使用 iMOP 培养基将 1 × 10⁶  个细胞接种至 6 cm 培养皿中。在第 0 天，使用 10 ml 移液器将培养物转移至 15 ml 锥形离心管中。通过重力沉降法收集耳球，方法如步骤 1.6 所述。使用 2 ml 吸液移液器吸除废弃培养基，使耳球保留在离心管底部。
4. 轻柔加入 2 ml 感觉上皮分化培养基。使用大口径 10 ml 移液器将耳球转移至 6 cm 培养皿中。
   注意：剧烈移液造成的机械剪切力可能导致耳球中的细胞解离。
5. 每隔一天向培养物中添加 2 ml 新鲜的感觉上皮分化培养基。必要时，可通过重力沉降法收集细胞，并更换培养基。
6. 在第 10 天，将培养物转移至 15 ml 锥形离心管中，按步骤 1.6 所述使耳球沉降。使用 2 ml 吸液移液器吸除废弃培养基，保持耳球不受扰动。
7. 在室温下，用含 4% 甲醛的 1× PBS 固定耳球 15 分钟。移除甲醛溶液后，用洗涤缓冲液（含 0.1% Triton X-100 的 1× PBS）洗涤耳球，随后在封闭缓冲液（含 10% 正常山羊血清和 0.1% Triton X-100 的 1× PBS）中孵育 1 小时。
   1. 更换缓冲液，将样品在含稀释抗体的封闭缓冲液中孵育，4 °C 下孵育。使用含 0.1% Triton X-100 的 1× PBS 洗涤样品，然后进行免疫染色。将耳球转移至 1× PBS 中，使用 P1000 移液器将耳球置于载玻片的封片剂中。盖上盖玻片，并在 4 °C 下使封片剂干燥。
8. 使用配备 16 位 CCD 相机以及 20× 0.75 空气物镜或 40× 1.3 NA 油浸物镜的倒置显微镜系统采集荧光图像。使用以下列出的（激发和发射）波长从不同荧光通道采集信号：蓝色（377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm），绿色（475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm），红色（562 ± 20 nm / 625 ± 20 nm）和红外（628 ± 20 nm / 692 ± 20 nm）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 厚度玻璃盖玻片（圆形，12 mm）	Electron Microscopy Sciences	72230-01
DMEM/F12	Life Technologies	11320-082
磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4	Life Technologies	10010-023
Hank's 平衡盐溶液（HBSS）	Life Technologies	14025-092
B27 补充剂（50X），无血清	Life Technologies	17504-044	以 1 ml 分装保存
Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Life Technologies	47743-736	以 10 mg/ml 的 100 µl 分装保存
Moxi Z Mini 自动细胞计数仪	Orflo	MXZ001
Moxi Z Cassette Type S	Orflo	MXC002
重组小鼠成纤维细胞生长因子，碱性（bFGF）	Peprotech	450-33	用含 0.1% BSA 的 H2O 重悬，并以 20 mg/ml 分装保存
羧苄青霉素，二钠盐	Thermo Fisher Scientific	BP2648-1	用 10 mM Hepes（pH 7.4）重悬，并以 100 mg/ml 分装保存
5 ml 移液管，单独纸包装（每箱 200 支）	Thermo Fisher Scientific	1367811D
10 ml 移液管，单独纸包装（每箱 200 支）	Thermo Fisher Scientific	1367811E
组织培养处理 6 cm 培养皿	Thermo Fisher Scientific	130181
TipOne 滤芯移液器吸头，0.1–10 µl，加长滤芯吸头	USA Scientific	1120-3810
TipOne 滤芯移液器吸头，1–20 µl，滤芯吸头	USA Scientific	1120-1810
TipOne 滤芯移液器吸头，1–200 µl ，滤芯吸头	USA Scientific	1120-8810
TipOne 滤芯移液器吸头，101–1000 µl，滤芯吸头	USA Scientific	1126-7810
15 ml 锥形管，无菌，20 袋，每袋 25 支（共 500 支）	USA Scientific	1475-0511
50 ml 锥形管，无菌，20 袋，每袋 25 支（共 500 支）	USA Scientific	1500-1211