将永生化多能耳源性前体细胞分化为螺旋神经节神经元及分化效果评估

摘要

来源：Azadeh, J.，等。启动永生化多能耳源性祖细胞的分化。J. Vis. Exp. (2016)。

该视频展示了永生化多能耳囊祖细胞（iMOPs）向螺旋神经节神经元（SGNs）的分化过程，以及通过免疫荧光方法对分化结果的验证。将iMOPs接种于包被有培养基质的盖玻片上，并置于神经元分化培养基中以诱导其分化为SGNs。对已分化的细胞使用特异性识别神经元分化标志物的抗体进行标记，并在显微镜下观察，以确认其分化效果。

方案

1. 诱导多能干细胞来源的神经元的分化

1. 配制50 ml神经元分化培养基：Neurobasal培养基、1× B27添加剂、2 mM L-谷氨酰胺。将50× B27添加剂和200 mM L-谷氨酰胺溶液在37 °C水浴中解冻5分钟。向48.5 ml Neurobasal培养基中加入1 ml 50× B27添加剂和0.5 ml 200 mM L-谷氨酰胺。
2. 将12 mm圆形1.5号盖玻片置于无菌10 cm培养皿中，加入70%乙醇（EtOH）浸泡，以消毒和清洁盖玻片。
3. 轻轻晃动盖玻片，确保其完全被乙醇覆盖。室温下静置 10 min。用无菌 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗盖玻片 3 次，以去除残留的乙醇。再用无菌 H₂O 冲洗盖玻片 1 次。₂O 以洗去残留的1×PBS。
4. 吸去 H₂使用2 ml吸液管吸取O，并让盖玻片自然干燥。将盖玻片置于组织培养超净台内，暴露于紫外光下照射15分钟。若不立即使用，应将盖玻片存放于无菌环境中。
5. 在24孔板的每个孔中放入一片12 mm圆形盖玻片。轻轻摇动培养板，确保盖玻片平贴于孔底。
6. 室温下解冻2 mg/ml的多聚-D-赖氨酸储备液，用1×PBS稀释至10 µg/ml的多聚-D-赖氨酸工作浓度。每孔加入0.25 ml 10 µg/ml的多聚-D-赖氨酸溶液。将培养板置于37 °C培养箱中孵育1小时。
7. 用无菌的1×PBS洗涤各孔3次。在室温下解冻10 mg/ml的层粘连蛋白储备液，并用1×PBS稀释至10 µg/ml。向24孔板的单个孔中加入0.25 ml的10 µg/ml层粘连蛋白工作液。将培养板置于37 °C培养箱中孵育。使用2 ml移液器吸除孔中的层粘连蛋白溶液。
8. 用 P1000 移液器加入 1 ml 1×PBS，再用 2 ml 吸管吸取弃去，重复洗涤盖玻片 3 次。最后一次洗涤后，将 1×PBS 留在孔中，直至细胞准备接种。通过收集、解离并计数细胞，启动神经元分化. 接种 1 × 10⁶ 细胞⁶ 6 cm 培养皿中的细胞，第 -3 天。
9. 第0天，收获、解离并计数细胞. 接种 1 × 10⁵ - 1.5 × 10⁵ 将iMOP细胞接种至24孔板中，每孔加入0.5 ml预热的神经元分化培养基。每隔一天吸除旧培养基，并更换为预热的神经元分化培养基。
10. 第7天在室温下用4%甲醛固定iMOP来源的神经元15分钟。去除甲醛溶液，用洗涤缓冲液（含0.1% Triton X-100的1×PBS）洗涤iMOP来源的神经元，随后在封闭缓冲液（含10%正常山羊血清和0.1% Triton X-100的1×PBS）中孵育1小时。
    1. 更换缓冲液，将样品置于含稀释抗体的封闭缓冲液中孵育，4 °C孵育。用含0.1% Triton X-100的1×PBS洗涤样品，进行免疫染色。在将盖玻片置于封片剂之前，先用1×PBS洗涤。封片剂于4 °C干燥后，再采集落射荧光图像.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 厚度玻璃盖玻片（圆形，12 mm）	Electron Microscopy Sciences 7	72230-01
DMEM/F12	Life Technologies	11320-082
Neurobasal 培养基	Life Technologies	21103
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4	Life Technologies	10010-023
B27 添加剂（50X），无血清	Life Technologies	17504-044	以 1 ml 分装保存
L-谷氨酰胺（200 mM）	Life Technologies	25030-081	以 5 ml 分装保存
天然小鼠层粘连蛋白	Life Technologies	23017-015	以 1 mg/ml 分装保存
Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Life Technologies	47743-736	以 10 mg/ml 的 100 µl 分装保存
Moxi Z Mini 自动细胞计数仪	Orflo	MXZ001
Moxi Z 卡盒，S 型	Orflo	MXC002
多聚-D-赖氨酸	Sigma	P7886	用 1X PBS 重悬，以 10 mg/ml 的 100 µl 分装保存
5 ml 移液管，单个纸质包装（每箱 200 支）	Thermo Fisher Scientific	1367811D
10 ml 移液管，单个纸质包装（每箱 200 支）	Thermo Fisher Scientific	1367811E
组织培养处理 Biolite 24 孔板	Thermo Fisher Scientific	130188
组织培养处理 Biolite 6 孔板	Thermo Fisher Scientific	130184
组织培养处理 6 cm 培养皿	Thermo Fisher Scientific	130181
EMD Millipore Millex 无菌 PVDF 针式滤器，孔径：0.22 μm	Thermo Fisher Scientific	SLGV033RS
TipOne 滤芯移液器吸头，0.1 - 10 μl，加长滤芯吸头	USA Scientific	1120-3810
TipOne 滤芯移液器吸头，1 - 20 μl，滤芯吸头	USA Scientific	1120-1810
TipOne 滤芯移液器吸头，1 - 200 μl，滤芯吸头	USA Scientific	1120-8810
TipOne 滤芯移液器吸头，101 - 1000 μl，滤芯吸头	USA Scientific	1126-7810
15 ml 圆锥形离心管，无菌，20 袋，每袋 25 支（共 500 支）	USA Scientific	1475-0511
50 ml 圆锥形离心管，无菌，20 袋，每袋 25 支（共 500 支）	USA Scientific	1500-1211