转基因小鼠胚胎动眼神经核脑片的离体培养与成像

摘要

来源：Whitman, M. C.，等。利用胚胎期表达GFP小鼠的离体动眼神经切片培养进行动眼神经突起生长的延时成像。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了转基因小鼠胚胎动眼神经核组织切片的离体培养与成像。首先分离胚胎并将其包埋于琼脂糖中，利用振动切片机获取包含动眼神经核及眼球的组织切片。将切片置于培养条件下，并使用荧光显微镜进行观察成像。

方案

所有动物模型操作均已经过当地机构动物护理委员会审查，且 JoVE 兽医审查委员会已审查所有动物模型操作。

1. 定时交配

1. 将 ISL^MN:GFP（胰岛运动神经元绿色荧光蛋白；MGI: J:132726；Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J Stock No: 017952）雄性和雌性小鼠于夜间合笼。在交配前称量雌鼠体重并记录。
   注意： ISL^MN:GFP 可特异性标记运动神经元，其表达的法呢基化绿色荧光蛋白无细胞毒性，定位于运动神经元及其轴突的细胞膜，可在发育过程中实现神经的可视化观察。其他荧光标记品系也可使用。
2. 于清晨检查阴道栓。发现阴道栓的当天记为胚胎发育0.5天（E0.5）。
3. 在胚胎发育第10.5天（E10.5）通过体重增加和/或超声成像确认妊娠。妊娠母鼠体重应至少增加1 g。在E10.5时可通过超声观察到胚胎。

2. 试剂与振动切片机的准备

1. 配制 500 mL 切片缓冲液：将 5 mL HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）和 5 mL 青霉素/链霉素加入 500 mL 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中。冷却至 4 °C。
   注意： 多余的切片缓冲液应储存在 4 °C，可用于后续的脑片培养实验。
2. 配制 50 mL 培养基：在无菌操作台中，将 12.5 mL HBSS、12.5 mL 胎牛血清（FBS）、250 µL 葡萄糖、250 µL L-谷氨酰胺和 125 µL HEPES 加入 24.4 mL Fluorobright DMEM（达尔伯克改良伊格尔培养基）中。（终浓度：含 25% HBSS、25% FBS、0.5% 葡萄糖、1 mM 谷氨酰胺和 2.5 mM HEPES 的 Fluorobright DMEM。）将培养基在无菌水浴中预热至 37 °C。
   注意： 培养基可在 4 °C 下保存最多 3 周。
   1. 在无菌操作台中，向 6 孔板的每孔加入 1.5 mL 培养基。向每孔中放入一个细胞培养插件（材料表）。将板置于 37 °C、5% CO₂ 的无菌培养箱中。
3. 配制 4% 低熔点琼脂糖：将 2 g 低熔点琼脂糖溶解于 50 mL 无菌 PBS 中。以 30–60 秒为间隔进行微波加热，直至完全溶解。置于 40 °C 水浴中以保持液态。
   注意： 多余的琼脂糖可在室温（RT）下保存，并在后续脑片培养实验中重新融化使用。
4. 设置振动切片机：在振动切片机上安装新刀片。检查设置参数：厚度为 400–450 µm。预冷切片机载物台。在外层腔室中放入一些冰块。使用专用于活体脑片的切片室和载物台。切勿将固定组织与活体脑片使用同一台振动切片机的切片室，因为残留的固定剂可能对脑片造成损伤。
5. 将显微镜载物台顶部培养箱预热至 37 °C 并通入 5% CO₂。
6. 准备解剖操作：清洁手术器械并喷洒 70% 乙醇。将两个培养皿中装满 HBSS 并置于冰上。打开一个 12 孔组织培养板，将盖子倒扣放在冰上。打开一个 6 孔组织培养板，在每孔中放入细胞培养膜插件并加入 1.5 mL 培养基。将该板预先放入 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中预热。

3. 收集 E10.5 胚胎并制备切片

注意：从这一步开始的所有操作都应尽快完成。始终将胚胎置于冰上。

1. 将怀孕母鼠（E10.5）置于 CO₂ 饱和室中实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
2. 用 70% 乙醇喷洒腹部，使用剪刀剪开腹腔，取出子宫并放入含有冰上预冷 HBSS 的培养皿中，迅速冲洗去除血液。将清洗后的子宫转移至第二个盛有冰上预冷 HBSS 的培养皿中。
3. 在解剖显微镜下，从子宫角和单个羊膜囊中分离出胚胎，将胚胎放置于 12 孔板盖子的内侧（倒置放置），并置于冰上保存。
4. 在解剖显微镜下，使用滤纸吸除每个胚胎周围的液体。
   注意：若滤纸接触胚胎，胚胎可能会粘附在滤纸上。
5. 将胚胎包埋于琼脂糖中。将熔化的琼脂糖倒在每个胚胎上，使其完全覆盖，并置于冰上。待琼脂糖凝固后，立即翻转每个胚胎，并在另一侧再添加一层琼脂糖。继续置于冰上冷却。
6. 使用荧光解剖显微镜，修剪胚胎周围的琼脂糖，以便后续将其正确固定在振动切片机的载物台上。动眼神经核及早期轴突发育呈荧光标记。调整胚胎方向，使动眼神经核、生长中的轴突与眼球呈一条直线，并使用刀片沿与此线平行的方向修整琼脂糖（位于胚胎背侧，见图1A）。
   注意：此面将被胶粘至振动切片机载物台（胚胎呈仰卧位，头部最靠近切片刀）。动眼神经核与眼球之间的连线应与振动切片机刀片保持平行。
7. 向振动切片机腔室中加入冰冻切片缓冲液。使用超级胶将胚胎牢固粘附于振动切片机载物台上，确保刀片与动眼神经核和眼球保持平行。待胶完全干燥后，将载物台浸入缓冲液中，使胚胎朝向远离刀片的方向。
8. 切取厚度为 400–450 µm 的组织切片。使用无菌移液管收集每一片切片，并置于冷切片缓冲液中。
9. 在解剖显微镜下，挑选出包含动眼神经核和眼球的切片。使用无菌移液管将其转移至 6 孔板中的细胞培养插件上，然后将培养板放回 37 °C 培养箱中。也可由一人负责切片，另一人同时进行切片转移，以尽量缩短从切片到放入培养箱之间的时间。
   注意：切片应以动眼神经核和轴突发出的荧光信号最接近成像显微镜物镜的方向放置。在倒置显微镜下，应将切片置于膜上，使核和轴突位于培养板下方，最接近物镜。
10. 从振动切片机载物台上清除残留琼脂糖，将下一个胚胎用超级胶固定于载物台，并重复步骤 3.7–3.9，直至所有胚胎均完成切片并接种。
11. 根据需要，在各孔培养基中加入抑制剂或重组分子，以建立剂量-反应曲线。使用适当的溶剂进行稀释。
    注意：若使用二甲基亚砜（DMSO），必须使用组织培养级 DMSO。也可将蛋白释放微珠置于切片的特定位置。
12. 将培养板置于配备 37 °C 及 5% CO₂ 环境的显微镜腔室内。设置显微镜每 30 分钟（或根据需要更频繁）对每一片切片拍摄相差图像和荧光图像。切片可维持培养 48–72 小时。

结果

图1： 示意图。E10.5 Isl^MN:GFP 胚胎（A：照片，B：示意图）在振动切片机上切成400–450 µm厚的切片，使切片同时包含动眼神经核和眼眶。A和B中的平行虚线表示振动切片机切割的位置。A图中的下部虚线表示琼脂糖应修剪并粘贴至振动切片机载物台的位置。（C）将组织切片平铺于组织培养膜上，以实现营养物质和气体的交换，并置于载物台培养箱中进行延时显微观察。在此阶段，可将抑制剂加入培养基中。（D）培养物可维持24–72小时，期间可观察到动眼神经轴突向眼球方向生长。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔组织培养板 G	Genesee Scientific	25-107
6孔组织培养板	Genesee Scientific	25-105
一次性巴斯德吸管（燧石玻璃）	VWR	14672-200
精细镊子	Fine Science Tools	11412-11
Fluorobrite DMEM	Thermo Fisher Scientific	A1896701
葡萄糖（200 g/L）	Thermo Fisher Scientific	A2494001
Hank's 平衡盐溶液（1X）	Thermo Fisher Scientific	14175-095
热灭活胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11550H
HEPES 缓冲液（1M）	Thermo Fisher Scientific	15630106
L-谷氨酰胺（250 nM）	Thermo Fisher Scientific	25030081
Loctite 超强胶	Loctite
低熔点琼脂糖	Thermo Fisher Scientific	16520050
Millicell 细胞培养插件（30 mm，亲水性 PTFE，0.4 µm）	Millipore Sigma	PICM03050
Moria 迷你穿孔勺	Fine Science Tools	10370-19
青霉素/链霉素（10,000 U/mL）	Thermo Fisher Scientific	15140122
培养皿（100 × 15 mm）	Genesee Scientific	32-107G
磷酸盐缓冲液（1X，pH 7.4）	Thermo Fisher Scientific	10010049
剃须刀片	VWR	55411-050
外科剪刀 - 钝头	Fine Science Tools	14000-12
Ti Eclipse 完美聚焦系统（含 TIRF）	Nikon
振动切片机（VT 1200S）	Leica	1491200S001
振动切片机刀片（双刃，不锈钢）	Ted Pella, Inc	121-6