使用荧光激活细胞分选法分离小鼠视网膜神经节细胞

摘要

来源：Chintalapudi, S. R.，等。通过流式细胞术分离原代小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）。J. Vis. Exp. （2017）

本视频演示了使用流式细胞术分离小鼠原代视网膜神经节细胞（RGCs）的操作流程。该方法可为未来RGCs的研究提供支持，旨在更深入地理解神经退行性疾病中功能性RGCs丢失所导致的视力显著下降机制。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 仪器、溶液和培养基的准备

注意： 本实验方案中所提及的材料、试剂、工具和仪器的全部信息均在材料表中详细列出。

1. 将所有解剖器械进行高压灭菌，并存放于无菌区域。使用以下器械：4 把标准镊子（2 把长镊和 2 把短镊）和 2 把剪刀，以及用于解剖的 2 把镊子（1 把长镊和 1 把短镊）和 1 把剪刀；另备一套作为备用。
2. 配制 100 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）/1% 胎牛血清（FBS）溶液，用于洗涤、免疫标记和细胞分选步骤。将溶液置于 4 °C 冷藏保存。
   注意：切勿向溶液中添加叠氮化钠（NaN₃），因其对活细胞具有毒性。
   1. 使用 99 mL PBS 和 1 mL FBS 配制 100 mL PBS/1% FBS 溶液。
3. 配制 100 mL 添加 3% FBS（见材料表）的无菌神经细胞培养基，用于细胞收集和培养。将细胞培养基在 4 °C 条件下保持无菌，仅在使用前升温至室温（RT）。
   1. 使用 97 mL 神经细胞培养基和 3 mL FBS 配制 100 mL 添加 3% FBS 的神经细胞培养基。
4. 将预先加入 5 mL 收集培养基的收集管（15-mL 管）放入冰桶中进行预冷。仅使用聚丙烯管，以防止细胞黏附于管壁。
5. 将 40-mm 培养皿、70-µm 尼龙筛网、注射器、细胞筛研磨杵以及无菌聚丙烯管放入生物安全柜中。在操作前对所有物品进行灭菌，并在整个操作过程中保持无菌状态。
   注意：视网膜收集后的所有步骤均需在生物安全柜中进行。

2. 视网膜细胞悬液的制备

1. 将采集的眼球置于解剖显微镜的底板上，开始角膜解剖。每次解剖一个眼球。
2. 使用镊子小心夹住视神经基部的眼球组织。此步骤建议使用一把长镊子和一把短镊子。
3. 使用30号（30G）锐利针头穿刺角膜，使房水从眼球中排出，从而更便于用镊子固定眼球。
4. 用镊子夹住角膜，使用剪刀在角膜上做一小切口。用镊子轻轻剥离角膜和巩膜。当眼球组织剥离至一半时，用镊子将视网膜和晶状体卷出。弃去角膜、巩膜和晶状体。
   注意： 此方法可确保视网膜完全从眼球其余部分分离。
5. 将视网膜放入含有PBS/1% FBS的小型40 mm培养皿中。
   注意： 除培养皿外，也可使用细胞培养皿。务必始终保持视网膜湿润，以模拟生理状态。
   1. 在生物安全柜内，用新鲜无菌的PBS/1% FBS将每个视网膜清洗三次。
6. 将最多12个视网膜置于已用PBS/1% FBS润湿的无菌70 µm尼龙滤网上。使用10 mL注射器的尾端，以环形动作轻轻研磨视网膜，使细胞解离。
   1. 替代方法：可使用研杵对细胞滤网进行研磨，或使用含15 IU/mL木瓜蛋白酶、5 mM L-半胱氨酸和200 U/mL DNase I的混合液在37 °C下消化15分钟，随后用PBS/10% FBS终止反应。
      注意： 比较酶消化法与注射器尾端或研杵机械研磨法时，细胞回收率百分比未见明显差异。
7. 为转移分离的细胞，将无菌70 µm尼龙滤网置于聚丙烯收集管上方。使用P1000移液器将收集的细胞通过滤网。用PBS/1% FBS冲洗滤网（步骤3.6），以释放残留细胞，并将其转移至收集管中。
8. 加入PBS/1% FBS，使终体积达到每只视网膜1 mL。将细胞悬液在室温下以200 × g离心7分钟。
   ​注意： 根据研磨的视网膜数量（< 6个），细胞沉淀可能过小而不可见。
   1. 弃去上清液，按每5个视网膜加入1 mL PBS/1% FBS的比例重悬细胞沉淀。
9. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
   1. 用70%乙醇清洁玻璃血细胞计数板和盖玻片。轻轻涡旋含有细胞的离心管，确保视网膜细胞悬液均匀分布。取20 µL 0.4%台盼蓝加入微量离心管中，再加入20 µL细胞悬液，混匀。
   2. 轻轻混匀后，取10 µL 0.4%台盼蓝/细胞悬液混合物滴加至血细胞计数板，使两个计数室均被填充；毛细作用将使混合液渗入盖玻片下方。在显微镜下计数所有未被台盼蓝染色的细胞，该数值代表活细胞数量。
   3. 使用以下公式计算细胞活力：活细胞数 / 总细胞数 = 活力百分比。
      注意： 若细胞活力低于95%，在进行荧光激活细胞分选（FACS）时需使用荧光染料以区分细胞活力。
10. 使用一种不能穿透活细胞的荧光活力染料。用PBS洗涤细胞以去除任何血清残留。在终体积为100 µL的溶液中，每5.0 × 10⁶个细胞加入1 µL荧光染料用于细胞活力鉴定。室温避光孵育15分钟。加入10倍体积的PBS/1% FBS。在室温下以200 × g离心5分钟。
11. 如有必要，可将细胞悬液在4 °C下孵育过夜。若进行此操作，应使用神经细胞培养基而非PBS/1% FBS填充细胞悬液管。将管子水平放置，并保持在4 °C环境中。

3. 视网膜细胞的免疫标记

1. 使用以下换算关系确定每细胞数量所需的抗体体积：每 5.0 × 10⁶ 个细胞使用 2 µL 抗体。⁶ 100 µL 体积的细胞
2. 用 PBS/1% FBS 洗涤细胞并维持细胞。取少量细胞（5.0 x 10⁶ 细胞）在分选设置时用作阴性对照（未标记）。
   注意： 该阴性对照对于细胞分选仪的正确校准至关重要。
3. 为最大限度减少抗体与表达 Fcγ 受体 II 和 III 的细胞发生非特异性结合，每 1.0 × 10⁶ 个细胞加入 1 µL 抗小鼠 CD16/32 抗体⁶ 在50 µL PBS/1% FBS终体积中重悬细胞，室温孵育10分钟。
4. 将抗体混合液加入样本中，轻轻吹打混匀。置于冰桶中孵育30分钟。确保冰桶加盖，避免光照，以免标记的荧光染料发生光漂白而影响实验结果。
   1. 使用以下荧光标记的抗小鼠抗体配制抗体混合液：CD90.2 AF（Alexa Fluor）-700、CD48 PE（Phycoerythrin）-Cy7、CD15 PE，以及未标记的CD57。
      ​注意： 每种抗体的使用浓度如下，按每 5.0 x 10⁶ 细胞：CD90.2 AF700，1 µg；CD48 PE-Cyanine7，0.4 µg；CD15 PE，0.02 µg；以及未标记CD57，0.4 µg。
      1. 根据以下计算使用相应体积（基于列于 材料清单）：总计 5.0 × 10⁷ 待标记的细胞；每5.0 x 10⁶个细胞使用2 µL⁶ 细胞 = 每种抗体20 µL；4种不同抗体 = 抗体混合液共80 µL；终体积 = [(5.0 x 10⁷ 总细胞数)/5.0 × 10⁶ 细胞] × 100 = 1,000 µL；80 µL 抗体 + 50 µL 抗小鼠 CD16/32 + 870 µL PBS/1% FBS = 1,000 µL。
         注意： 该组合为仪器配置提供了最优的荧光染料组合。以下参数总结了各荧光染料的发射与激发特性：AF-700 在638 nm红色二极管激光激发下，发射波长为719 nm；PE-Cyanine7 在488 nm蓝色二极管激光激发下，发射波长为767 nm；PE 在488 nm蓝色二极管激光激发下，发射波长为575 nm。
5. 30分钟孵育后，用PBS/1% FBS将体积调至5 mL。在200 × g、室温条件下离心7分钟，洗涤样本。重复此步骤一次，以去除所有未结合的抗体。
6. 加入2 µL二抗（0.1 µg），该抗体将结合5.0 × 10⁶个细胞的CD57。置于冰桶中孵育30分钟，操作同步骤3.4。按步骤3.5所述，洗涤细胞两次。
   1. 如果在步骤3.4中使用了未标记的一抗，则用二抗对细胞进行标记。
      ​注意： 此配置推荐使用的二抗列于下表 材料列表；其发射波长为421 nm。使用405 nm紫色二极管激光激发时，应搭配450/50 nm带通滤光片。
   2. 使用体积根据以下计算（基于列表中 commercially available antibody 的说明） 材料表）：每 5.0 × 10⁶ 个细胞加入 2 µL⁶ 细胞 = 20 µL 二抗；终体积 = [(5.0 x 10⁷ 总细胞数)/5.0 × 10⁶ 细胞] × 50 = 500 µL；20 µL 抗体 + 480 µL PBS/1% FBS = 500 µL。
7. 将标记的细胞保存在PBS/1% FBS中。使用血细胞计数板对细胞进行计数；最终视网膜细胞浓度为3.0 - 4.0 x 10⁷ cells/mL
   注意： 不要使用细胞培养基稀释细胞，因为酚红会增加自发荧光，从而降低阴性细胞与阳性细胞之间的分辨度。每单位体积的最终细胞浓度在很大程度上取决于仪器配置的流速。
8. 在设置过程中使用单色对照以减少荧光溢出。
   注意： 此步骤也称为补偿，用于校正由荧光染料组合所产生的干扰信号。在 PBS/0.1% BSA/2 mM NaN3 中的聚苯乙烯微球可结合来自多个物种的荧光标记免疫球蛋白（Ig）同种型，可作为阳性对照用于设置补偿。
   1. 将3滴聚苯乙烯微球加入无菌FACS管中，每种荧光染料各分配一管。向每管中加入1 µg相应的荧光染料。室温避光孵育15分钟。向样品管中加入3 mL PBS/1% FBS。在200 × g、室温条件下离心5分钟。小心移除上清液，并将沉淀重悬于250 µL PBS/1% FBS中。
   2. 设置阴性对照时，使用不与Ig结合的聚苯乙烯微球。如有必要，可在前一天进行此步骤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Anti-mouse CD15 PE	BioLegend	125606	克隆 MC-480
Anti-mouse CD48 PE-Cy7	BioLegend	103424	克隆 HM48-1
Anti-mouse CD57	Sigma Aldrich	C6680-100TST	克隆 VC1.1
Anti-mouse CD90.2 AF700	BioLegend	105320	克隆 30-H12
Brilliant Violet 421 山羊抗小鼠 IgG	BioLegend	405317	克隆 Poly4053
纯化抗小鼠 CD16/32	BioLegend	101302	FcgRII/III 封闭剂，克隆 93
胎牛血清	Hyclone	SH30071.03	美国来源
AbC 总抗体补偿微珠试剂盒	Thermo Fisher Scientific	A10497	多物种 Ig
Neurobasal 培养基	Thermo Fisher Scientific	21103049	培养前向培养基中添加血清
磷酸盐缓冲盐水 (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010049	生理盐水溶液
解剖显微镜	Olympus	SZ-PT 型号	体视显微镜
Sorvall 离心机	Thermo Scientific	ST 16R	所有离心操作均在室温下进行
底板 – 解剖盘	Fisher Scientific	SB15233FIM	也可使用石蜡板
镊子	Aesculap	5002-7	4 ½ 英寸
直型虹膜剪	Aesculap	1360	5 ½ 英寸
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	352097	聚丙烯管
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	352098	聚丙烯管
BD FACS 管	Fisher Scientific	352003	聚丙烯管
40 mm 培养皿	MidSci	TP93040	组织培养处理
70 μm 尼龙滤网	MidSci	70ICS	无菌
40 μm 尼龙滤网	MidSci	40ICS	无菌
BD 10 mL 注射器	Fisher Scientific	301604	无针一次性注射器
研磨棒	MidSci	PEST	无菌
Wheaton 小瓶	Fisher Scientific	986734	无衬垫
BD 30 G 针头	Fisher Scientific	305128	1 英寸
Hausser Scientific Bright-Line 玻璃计数室	Fisher Scientific	0267151B	血细胞计数板
Gibco 台盼蓝 0.4% 溶液	Fisher Scientific	15250061	细胞活力染料
Eppendorf 管	Fisher Scientific	05-402-25	1.5 mL
EVOS Floid 细胞成像系统	Thermo Fisher Scientific	447113	使用 20x 物镜进行荧光成像
100% 乙醇	Fisher Scientific	04-355-452	用于配制 70% 乙醇
Pipet-Lite LTS 移液器 L-1000XLS+	Rainin	17014282	LTS 移液器
Pipet-Lite LTS 移液器 L-200XLS+	Rainin	17014391	LTS 移液器
Pipet-Lite LTS 移液器 L-20XLS+	Rainin	17014392	LTS 移液器
LTS 1000 μL 架 – GPS-L1000S	Rainin	17005088	蓝色架，无菌吸头
LTS 250 μL 架 – GPS-L250S	Rainin	17005092	绿色架，无菌吸头
LTS 20 μL 架 – GPS-L10S	Rainin	17005090	红色架，无菌吸头
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