将人诱导性多能干细胞分化为脑微血管内皮细胞

摘要

来源：Pong, S. 等，由人诱导性多能干细胞衍生、扩增、冷冻保存及表征脑微血管内皮细胞。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种将人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为脑微血管内皮细胞的多步骤过程。所获得的分化细胞在特性上高度模拟脑微血管内皮细胞，具有紧密连接结构，是研究脑部疾病的理想模型。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

注意：简而言之，成纤维细胞通过基于mRNA的基因重编程技术被重编程为诱导多能干细胞（iPSC）。iPSC在干细胞培养基（SCM）（参见材料列表）中维持培养，并以约1.2 × 10² 个细胞/mL的密度储存，每管加入1 mL SCM、10 μM的Rho相关蛋白激酶抑制剂（ROCKi）Y-27632以及10%（v/v）二甲基亚砜（DMSO），置于液氮中于-160 °C进行冷冻保存。以下所有操作均在生物安全柜中进行，除非另有说明。

1. 基底膜基质稀释与包被培养板

1. 用不含酚红的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）将从 Engelbreth-Holm-Swarm 瘤中纯化的生长因子减少型基底膜基质按 1:50 稀释。
2. 用适量稀释后的基底膜基质包被细胞培养板（例如，6 孔板 = 1 mL，12 孔板 = 0.5 mL），并在 37 °C 下孵育至少 1 小时。

2. 诱导性多能干细胞（iPSC）的培养与维持

注意：6 孔平底板中每个孔的最大汇合度约为 1.2 × 10⁶ 个细胞。

1. 将冻存的iPSCs解冻后加入含10 μM Y-27632的SCM中，接种至经稀释的生长因子减少型基底膜基质包被的6孔板中。
2. 解冻后前24小时，在含10 μM Y-27632的SCM中培养iPSCs。24小时后更换新鲜培养基。
3. 在传代前，将iPSCs维持在SCM中，直至细胞融合度达到80–90%。
   1. 通过将分化所需密度（15,600 个细胞/cm²）乘以孔的表面积，计算分化所需的iPSC数量。对于6孔平底板，将15,600 个细胞/cm²² 9.6 厘米² 共计每孔 149,760 个细胞。
4. 传代时，用Hanks平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞，随后在37 °C下用非酶解的乙二胺四乙酸（EDTA）（见材料列表）孵育细胞5分钟。
   1. 使用细胞刮棒轻轻刮下细胞。将细胞收集至新鲜的 SCM 中。
   2. 将细胞接种至经稀释的 SCM 包被的细胞培养板中，并按照步骤 2.3 所述方法培养细胞，或于约 1.2 x 10⁶⁶ 细胞/mL，加入1 mL SCM、10 μM Y-27632 和10% DMSO（v/v），分装至冻存管中，于液氮中-160 °C保存。

3. 将iPSC诱导分化为BMEC

注意：非酶法 EDTA 会将细胞分离成团块，而酶法 EDTA（见材料表）可将细胞分离成单细胞悬液。视黄酸（RA）应避光保存。

1. 用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤iPSCs一次。在37 °C下用酶解EDTA孵育（6孔板加1 mL，12孔板加0.5 mL，24孔板加0.25 mL）约5分钟，以获得单细胞悬液。
2. 收集细胞，在室温下以300 × g（相对离心力）离心5分钟。将细胞沉淀重悬于含有10 μM Y-27632的SCM中。
3. 使用台盼蓝染色和自动细胞计数仪或血细胞计数板测定细胞密度。以15,600个细胞/cm²的密度，或在表面积为9.6 cm²/孔的6孔平底板中每孔接种149,760个细胞，接种于含10 μM Y-27632的SCM中，培养24小时。
4. 24小时后开始诱导分化，将SCM更换为E6培养基。随后连续4天每天更换E6培养基。
5. 分化第4天，将E6培养基更换为添加了稀释（1:200）B27补充剂、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和10 μM RA的人内皮细胞无血清培养基（hESFM）。接下来48小时内不再更换此培养基。
6. 配制200 mL含稀释（1:200）B27的hESFM，将1 mL 50倍浓缩的B27补充剂加入199 mL hESFM中混匀。
7. 通过将50 μg bFGF溶解于250 μL Tris缓冲液（5 mM Tris，pH 7.6，150 mM氯化钠，NaCl）中配制成200 μg/mL的储存液，从而获得20 ng/mL的bFGF工作浓度。将20 μL 200 μg/mL的bFGF加入200 mL hESFM中，配制成含20 ng/mL bFGF的200 mL hESFM。
8. 配制10 μM RA：首先将100 mg RA粉末溶于2.5 mL DMSO中，配制成40 mg/mL的RA储存液；再将该溶液稀释至3 mg/mL，得到10 mM的储存液。取200 μL 10 μM RA加入200 mL hESFM中，配制成含10 μM RA的200 mL hESFM。

4. 用于纯化iPSC来源的BMEC的IV型胶原蛋白（COL4）和纤连蛋白（FN）基质包被

1. 向2 mg FN中加入2 mL无菌水，配制成1 mg/mL的FN储存液。向5 mg COL4中加入5 mL无菌水，配制成1 mg/mL的COL4储存液。
   1. 将FN在37 °C下溶解至少30分钟，COL4在室温下溶解。
2. 用无菌水将FN储存液稀释至终浓度为100 μg/mL，将COL4储存液稀释至终浓度为400 μg/mL。
3. 用400 μg/mL COL4和100 μg/mL FN的混合溶液包被所需培养板（6孔板每孔加入1 mL，12孔板每孔0.5 mL，24孔板每孔0.25 mL，12孔Transwell滤膜板每孔0.25 mL）。
4. 将培养板在37 °C孵育至少2小时或过夜；对于Transwell滤膜板，建议至少孵育4小时。

5. iPSC来源的BMEC的传代培养与纯化

注意：根据分化第6天细胞的汇合度，使用酶解EDTA孵育的时间可能超过15分钟。

1. 分化第6天，用DPBS洗涤细胞两次。加入1 mL酶解EDTA，在37°C孵育至少15分钟，直至获得单细胞悬液。
2. 在室温下以300 × g离心5分钟收集细胞。用新鲜的hESFM重悬细胞沉淀，培养基中添加稀释（1:200）的B27补充剂、20 ng/mL bFGF和10 μM RA。
3. 将细胞接种至包被有400 μg/mL COL4和100 μg/mL FN混合物的培养板上。接种比例为1个6孔板孔对应3个12孔板孔、3个12孔Transwell滤膜板孔或6个24孔板孔。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase	Sigma Aldrich	A6964-100mL
B27 补充剂	Thermo Fisher Scientific	17504044
人胎盘来源的 IV 型胶原蛋白	Sigma Aldrich	C5533-5mg
Corning 2 mL 内螺纹聚丙烯冻存管	Corning	8670
Corning Costar 平底细胞培养板（6 孔）	Corning	353046
DMEM/F12（不含酚红）	Thermo Fisher Scientific	A1413202
DMSO	Sigma Aldrich	D2438-50mL
DPBS (+/+)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	14040-117
Essential 6 培养基（Thermo Fisher）	Thermo Fisher Scientific	A1516401
纤连蛋白	Sigma Aldrich	F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free 低生长因子基底膜基质	Thermo Fisher Scientific	A1413202
含钙和镁的 Hanks 平衡盐溶液	Thermo Fisher Scientific	24020-117
人内皮细胞无血清培养基	Thermo Fisher Scientific	11111044
Invitrogen Countess 自动细胞计数仪	Thermo Fisher Scientific	N/A
视黄酸	Sigma Aldrich	R2625-100MG
Y-27632 二盐酸盐（ROCK 抑制剂）	Tocris/Thermo Fisher Scientific	1254
台盼蓝染液（0.4%），用于 Countess 自动细胞计数仪	Thermo Fisher Scientific	T10282