将人诱导性多能干细胞分化为脑微血管内皮细胞

摘要

来源：Pong, S. 等，由人诱导性多能干细胞衍生、扩增、冷冻保存及表征脑微血管内皮细胞。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种将人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为脑微血管内皮细胞的多步骤过程。所获得的分化细胞在特性上高度模拟脑微血管内皮细胞，具有紧密连接结构，是研究脑部疾病的理想模型。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

注意：简而言之，成纤维细胞通过基于mRNA的基因重编程技术被重编程为诱导多能干细胞（iPSC）。iPSC在干细胞培养基（SCM）（参见材料列表）中维持培养，并以约1.2 × 10² 个细胞/mL的密度储存，每管加入1 mL SCM、10 μM的Rho相关蛋白激酶抑制剂（ROCKi）Y-27632以及10%（v/v）二甲基亚砜（DMSO），置于液氮中于-160 °C进行冷冻保存。以下所有操作均在生物安全柜中进行，除非另有说明。

1. 基底膜基质稀释与包被培养板

1. 用不含酚红的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）将从 Engelbreth-Holm-Swarm 瘤中纯化的生长因子减少型基底膜基质按 1:50 稀释。
2. 用适量稀释后的基底膜基质包被细胞培养板（例如，6 孔板 = 1 mL，12 孔板 = 0.5 mL），并在 37 °C 下孵育至少 1 小时。

2. 诱导性多能干细胞（iPSC）的培养与维持

注意：6 孔平底板中每个孔的最大汇合度约为 1.2 × ....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase	Sigma Aldrich	A6964-100mL
B27 补充剂	Thermo Fisher Scientific	17504044
人胎盘来源的 IV 型胶原蛋白	Sigma Aldrich	C5533-5mg
Corning 2 mL 内螺纹聚丙烯冻存管	Corning	8670
Corning Costar 平底细胞培养板（6 孔）	Corning	353046
DMEM/F12（不含酚红）	Thermo Fisher Scientific	A1413202
DMSO	Sigma Aldrich	D2438-50mL
DPBS (+/+)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	14040-117
Essential 6 培养基（Thermo Fisher）	Thermo Fisher Scientific	A1516401
纤连蛋白	Sigma Aldrich	F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free 低生长因子基底膜基质	Thermo Fisher Scientific	A1413202
含钙和镁的 Hanks 平衡盐溶液	Thermo Fisher Scientific	24020-117
人内皮细胞无血清培养基	Thermo Fisher Scientific	11111044
Invitrogen Countess 自动细胞计数仪	Thermo Fisher Scientific	N/A
视黄酸	Sigma Aldrich	R2625-100MG
Y-27632 二盐酸盐（ROCK 抑制剂）	Tocris/Thermo Fisher Scientific	1254
台盼蓝染液（0.4%），用于 Countess 自动细胞计数仪	Thermo Fisher Scientific	T10282