在多电极阵列上分离与培养鸡胚神经元

摘要

来源：Sanchez, K. R.，等，利用多电极阵列评估内分泌干扰物对脊椎动物神经网络功能发育的影响。J. Vis. Exp.(2018)

本视频演示了一种从早期鸡胚前脑中分离神经元并在微电极阵列上进行培养以形成神经元网络的方法。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 材料准备

1. 将鸡胚蛋置于市售的台式蛋孵育器中，在 37 °C 下孵育。用于获取 E7 胚胎的蛋孵育 7 天。
2. 准备多电极阵列（MEAs）。在生物安全二级（BSLII）操作台中，将所需数量的 MEAs 浸入 70% 乙醇中 3 至 4 小时进行灭菌，随后用约 10 mL 无菌蒸馏水冲洗三次。
   注意： MEAs 包含 64 个纳米多孔铂电极，排列成 8 × 8 网格。电极直径为 30 µm，电极间距为 200 µm。切勿使用变性乙醇对 MEAs 进行灭菌，否则会导致腐蚀。
3. 将 MEAs 放入带盖的无菌容器中（以维持无菌状态），并转移至台式孵育器。在 55 °C 下烘烤至少 6 小时。此步骤对充分灭菌至关重要，温度不得超过 60 °C。为保持无菌状态，将盛有 MEAs 的培养皿转移至 BSLII 操作台中存放，直至后续使用。
   注意： 我们使用耐高温玻璃烤盘配塑料盖，并用 70% 乙醇对其表面进行灭菌后，置于 BSLII 操作台中干燥。
4. 分装细胞外基质（ECM）溶液。在 4 °C 下过夜解冻试剂瓶，并将 100 µL 分装后于 -20 °C 冻存。
   注意： ECM 以冷冻状态运输。在准备包被前不应升至室温，因其在室温下会发生聚合，一旦聚合则无法用于包被。建议使用不含生长因子的 ECM，以避免未知因子带来的额外影响。
5. 使用 70% 乙醇对所有解剖器械（Dumont #5 镊子、弯头镊、小剪刀和弹簧剪刀）以及涂有自密封材料的解剖皿进行灭菌，并在解剖操作台中晾干。

2. 鸡胚神经元培养与神经网络活动

1. 铺板当天，从 -20 °C 冰箱中取出一管 ECM，用 70% 乙醇喷洒后置于冰上。在 BSLII 生物安全柜内，加入 300 µL 冷的 Neurobasal 培养基，将其稀释至 25%。
2. 使用 P200 移液器，将 100 µL 25% ECM 加至 MEA 的中央，注意不要触碰电极，立即移开，使表面形成一层薄膜。盖好 MEA，放入 CO₂ 培养箱（37 °C，5% CO₂）中，待用于神经元接种。
3. 用 70% 乙醇对 E7 鸡蛋（孵化第 7 天胚胎，于 37 °C 孵育 7 天）外壳进行消毒。将胚胎头部切断，放入底部铺有 Sylgard 的解剖皿中，皿内含无钙的冷灭菌 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）。沿眼部周围剪开并取出眼球。使用 Dumont #5 精细镊子和弹簧剪，在腹侧做切口，去除外层皮肤以暴露前脑和视顶盖。小心剥离并去除软脑膜。将前脑转移至另一培养皿中，用弹簧剪将其切成约 2 mm 的小块。
   注意：去除软脑膜后，前脑组织上不应残留任何血管。如有条件，建议在无菌解剖罩内进行解剖操作；但只要器械和操作区域已用 70% 乙醇彻底灭菌，即使在罩外操作，也可获得较理想的结果。
4. 使用无菌移液管将前脑组织块收集至 15 mL 离心管中，待组织块沉降至管底后，尽可能吸除 HBSS 溶液。
5. 加入 1 mL 预热至 37 °C 的 0.05% 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（Trypsin/EDTA），于 37 °C 孵育 15 分钟。
6. 使用巴斯德移液管小心吸除胰蛋白酶，避免扰动组织块，随后加入 1 mL Neurobasal 培养基。待组织块沉降后吸除培养基。重复清洗一次。此步骤旨在彻底去除残留的胰蛋白酶/EDTA。
7. 加入 2 mL Neurobasal 培养基，开始吹打。吹打操作需使用无菌火焰抛光的巴斯德移液管，轻柔地将组织反复吹过移液管数次，直至肉眼不可见组织块。若多次吹打后仍有残余组织块，可静置使其沉降。
   注意：吹打过程中应避免产生气泡；若出现泡沫，应立即停止操作，并通过抽吸去除泡沫。
8. 用 Neurobasal 培养基将重悬细胞按 1:10 比例稀释，使用台盼蓝染色和血细胞计数板计数活细胞。取 50 µL 稀释后的细胞悬液与 50 µL 台盼蓝溶液混合于 0.5 mL 离心管中。将盖玻片置于计数板上后，加入 10 µL 混合液，计数透亮清晰的细胞（蓝色细胞为死细胞，不应计入）。
   注意：单个 E7 视顶盖组织通常可获得 1 至 5 × 10⁷ 个细胞/mL。
9. 将解离后的细胞以 2,200 个细胞/平方毫米的密度接种至 ECM 包被的 MEA 上。对于本实验所用 MEA 系统，相当于每张 MEA 接种约 130,000 个细胞。加入 Neurobasal 培养基使 MEA 内总体积达到 1 mL，将 MEA 置于 CO₂ 培养箱中过夜，以促进细胞贴壁和神经突起延伸（图 1）。
   注意：对于不同面积和电极数量的 MEA，可尝试不同细胞密度——通常，较高细胞密度可增强网络活性，但也可能导致培养物寿命缩短。

结果

图1：本实验方案的示意图，展示从鸡前脑解剖、细胞解离、接种培养到记录神经网络活动的各个步骤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#5 镊子	Fine Science Tools	11251-10
Axion Muse MEA	Axion Biosystems	M64-GL1-30Pt200
弯头镊子	Fine Science Tools	11272-50
乙醇	Sigma-Aldrich	64-17-5
HBSS	Fisher	14170112
血细胞计数板	Fisher	02-671-6
低生长因子 Matrigel，无酚红	BD Biosciences	356231
Neurobasal 培养基	BrainBits	Nb4-500
巴斯德吸管	Fisher	13-678-20A
弹簧剪	Fine Science Tools	15514-12
底部为 Sylgard 的解剖皿	Living Systems Instrumentation	DD-90-S-BLK-3PK
台盼蓝染料	Fisher	15-250-061
胰蛋白酶-EDTA	Fisher	15400054