使用 iPSC 衍生的前体细胞生成血脑屏障芯片

摘要

来源:Jagadeesan， S.， et al.， 基于人类 iPSC 的血脑屏障芯片的生成。 （2020 年）。

该视频展示了使用 iPSC 衍生的前体细胞创建血脑屏障芯片。它涉及将神经祖细胞和脑微血管内皮细胞接种在具有多孔膜的单独通道中。通过流动分化培养基，内皮细胞形成类似于血管的紧密连接，神经细胞成熟为各种脑细胞类型，在芯片上建立功能性血脑屏障。

方案

1. iPSC 衍生的神经祖细胞 （iNPC） 的产生

1. 如下所述和以前发表的从 iPSC 集落产生 EZ 球。
   1. 在 mTESR1 或其他商业培养基中，在基底膜基质包被的 6 孔板 （0.5 mg/板） 上培养 iPSC 集落至汇合（参见材料表）。
   2. 去除 iPSC 培养基并替换为 2 mL EZ-球体培养基 [ESM;DMEM:F12 7:3 补充 100 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）、100 ng/mL 表皮生长因子、5 μg/mL 肝素和 2% B27 补充剂]。
   3. 用无菌 1000 μL 移液器吸头或细胞刮刀的背面刮擦每个汇合孔的底部。
   4. 收集所有细胞并将它们置于超低附着度 T25 培养瓶中，以允许自发形成自由漂浮的球体。在 37 °C 下孵育过夜。
   5. 当培养基变黄时，每 2-3 天用新鲜的 ESM 替换一半的培养基，以换取球体。这允许球体保持在条件培养基中，这对于它们的生长和维持非常重要。
      1. 将培养瓶靠在试管架上，让球体在重力作用下沉降 1-2 分钟，直至培养瓶的一角。
      2. 沉淀后，用 5 mL 或 10 mL 血清移液管吸出一半的上清液，并用新鲜的预热 ESM 替换。
   6. 如前所述，通过将球体切碎至 200 μm 直径，每周通过 EZ 球体。EZ 球体最多可维持 25 次传代，非常适合在第 8-25 代之间使用。
2. 准备 iNPC 的单细胞悬液:
   1. 为了诱导神经分化，将 EZ 球解离成单个细胞。
   2. 切碎后 3-4 天从 T75 培养瓶中收集球体，并将其转移到 15 mL 锥形瓶中，然后静置 2 分钟或直到所有球体都沉淀在底部。
   3. 用 5 mL 移液器缓慢去除 ESM，不要破坏沉淀的球体。加入 1 mL 解离溶液（参见材料表）并在 37 °C 下孵育 10 分钟。
   4. 孵育 5 分钟后旋转解离溶液和球体，以确保处理任何沉淀的球体。
   5. 慢慢去除解离溶液。加入 1 mL 神经分化培养基 [NDM;DMEM:F12 含 2% B27 减去维生素 A、1% N2 补充剂和人脑来源的神经营养因子（hBDNF，20 ng/mL）]。
   6. 使用 1 mL 移液器，然后用 200 μL 移液器移液，将球体研磨成单细胞，直到所有球体解离。避免在研磨过程中形成气泡。
   7. 使用血细胞计数器对解离的细胞进行计数，并将细胞稀释至最终密度为 1 x 10⁶ 个细胞/mL。可以根据应用更改密度。
      注意:对于长达 3 天的短期培养，建议使用更高的密度（高达 6 x 10⁶ 个细胞/mL），对于长达 3 周的长期应用，建议使用较低的密度><。 注意: 细胞现在已准备好接种到芯片的顶部通道中，以形成"大脑侧"。

2. iPSC 向 iBMEC 的分化

1. 将 iPSC 以 1:6 的比例从 6 孔板的单个汇合孔传代到 6 孔基底膜基质包被板中。让细胞粘附 24 小时。每天更换 iPSC 培养基。
2. 每天使用血细胞计数器对细胞进行计数。
3. 当细胞密度达到 1.5–3.0 x 105 个细胞/孔时，用 3 mL 不含 bFGF 的未条件培养基替换 iPSC 培养基 [DMEM:F12 1:1，含 10% 敲除血清替代物 （KOSR）、1% 非必需氨基酸 （NEAA）、0.5% 谷氨酰胺补充剂（材料表）和 100 μM β-巯基乙醇]。每天更换培养基，持续 6 天。
4. 在第 6 天，用内皮细胞 （EC） 培养基 [补充有 1% 贫血小板血浆来源的牛血清、20 ng/mL bFGF 和 10 μM 全反式维甲酸 （RA） 的人内皮无血清培养基 （hESFM）] 替换培养基。将培养基放置 2 天。
5. 去除 EC 培养基，每孔加入 1 mL 解离溶液。在 37 °C 下孵育 35 分钟
   注意:虽然这被认为是在此处使用的解离溶液中较长的孵育时间，但 iBMEC 可以承受这种处理，细胞活力高于 90%。
6. 轻轻移液细胞悬液并将所有细胞收集到 15 mL 锥形管中，将细胞从孔中分离。
   注意: 避免刺激性移液。如果细胞不易分离，请再孵育 5 分钟。
7. 向 15 mL 锥形瓶中加入 1 体积的 EC 培养基以灭活 Accutase，以 200 x g 离心 5 分钟，去除培养基，然后用 1 mL EC 培养基（不含 bFGF 和 RA）替换。
8. 使用血细胞计数器对细胞进行计数，并将细胞密度调整为 14–20 x 10⁶ 个细胞/mL><。 注意: 细胞现在已准备好接种到芯片的底部通道中，以形成"血液侧"。

3. 器官芯片的微加工

1. 如前所述，将风琴芯片用于 BBB 芯片模型及其生产。高通道器官芯片（见材料表）由高柔性聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 弹性体制成，该弹性体包含两个叠加且平行的微尺度通道，由柔性多孔膜隔开。顶部和底部微通道尺寸分别为 1 mm x 1 mm 和 1.0 mm x 0.2 mm。两个通道由 50 μm 厚的 PDMS 制成的柔性多孔膜隔开，该膜包含直径为 7 μm 的孔，间距为 40 μm。分隔通道的多孔膜的表面积为 0.171 cm²。

4. 筹码准备

1. Organ 芯片预包装在芯片载体内，无需在处理过程中干扰或扭曲芯片对准。此外，芯片载体安全地连接到便携式模块（"Pod"），该模块充当培养模块和芯片之间的接口。
   1. 用 70% 乙醇喷洒芯片包装，然后将其带入生物安全柜 （BSC）。
   2. 打开包装，将器官芯片放在无菌培养皿中。只能从侧面处理芯片托架，以避免直接接触芯片。
   3. 确保载体的标签朝右（图 1），当使用多个芯片时，将它们全部对齐到相同的方向。
   4. 在载体选项卡上标记每个芯片（完整的芯片制备和工作流程如图 2 所示）。

5. 表面活化和 ECM 涂层

1. 表面活化液的制备
   1. 模拟试剂 1 （ER-1） 装在含有 5 mg 的小瓶中，对光敏感。使用前立即准备新鲜的 ER-1 溶液。ER-1 完整性对于成功制备芯片至关重要。
   2. 处理 ER-1.
      时关闭 BSC 中的灯 注意: ER-1 对眼睛有刺激性，必须在 BSC 中戴上适当的手套和护目镜进行处理。
   3. 使用前，让 ER-1 和 ER-2 试剂平衡至室温 （RT）。
   4. 用箔纸包裹空的无菌 15 mL 锥形管，以保护溶液避光。
   5. 在 BSC 中，短按一下 ER-1 样品瓶，使粉末沉淀在底部。
   6. 向样品瓶中加入 1 mL ER-2 缓冲液，并立即将其内容物转移到 15 mL 包装锥形管的底部。不要用移液器混合。转移到锥形管的溶液的颜色将为红色。
   7. 重复步骤 5.1.6 3 次。在最后一轮中，盖上 ER-1 样品瓶的盖子并倒置以从盖子中收集任何残留的粉末，然后将溶液转移到锥形管中;这将使总体积达到 4 mL 的 ER-1 溶液。
   8. 将 6 mL ER-2 溶液添加到 15 mL 锥形管中的 4 mL ER-1 溶液中，至终浓度为 0.5 mg/mL。ER-1 应完全溶解在 ER-2 溶液中。
2. 表面活化
   1. 使用 P200 移液器和无菌 200 μL 过滤移液器吸头，吸取 200 μL ER-1 混合物。
   2. 将移液器放入底部入口，将 20 μL ER-1 混合物推入底部通道，直到混合物开始从底部通道出口流出。
   3. 加入大约 50 μL 的 ER-1 混合物，并将其置于顶部通道入口处。将混合物推过顶部通道，直到它开始从顶部通道出口流出。
   4. 轻轻吸液，从芯片表面去除所有多余的 ER-1 混合物。确保 ER-1 混合物仅从芯片表面去除，而不是从通道中去除。
   5. 在紫外线 （UV） 激活之前，验证通道是否没有气泡。如果检测到气泡，请用 ER-1 混合物清洗通道以去除气泡。
   6. 将装有薯片的打开培养皿放入紫外线灯箱（由 Emulate Inc. 提供）中。
   7. 将 UV 灯箱背面的开关设置为 "一致" 设置。打开电源并启动 UV 激活。将木片置于紫外线下 20 分钟
      注意: 避免人员暴露在紫外线下。
   8. 从两个通道中去除 ER-1 混合物。
   9. 用 200 μL ER-2 溶液清洗每个通道。
   10. 从两个通道中取出 ER-2。
   11. 用 200 μL 无菌冷 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 清洗每个通道。
   12. 将冷 DPBS 留在通道内，直到继续下一步。
3. 细胞外基质 （ECM） 制备和包被
   1. 通过将各个 ECM 组分与冷 DPBS、水或其他溶剂混合至最终工作浓度来制备 ECM 溶液。每次使用时，ECM 溶液都应新鲜制备。
   2. 用 ECM 包被芯片的顶部和底部通道，其组成由要接种的细胞类型决定。ECM 混合物必须在冰上保持使用。
   3. 使用层粘连蛋白 （50 μg/mL） 涂覆"脑侧"，胶原蛋白 IV 和纤连蛋白以 4:1 的比例 （320:80 μg/mL） 混合以涂覆"血液侧"，如第 5.6 节所述。
4. ECM 等分试样的制备
   1. 在冷 DPBS 中稀释 1 mg/mL 层粘连蛋白至终浓度为 50 μg/mL。分装并储存在 -20 °C 直至使用。
   2. 将胶原蛋白 IV 溶解在 0.1% 乙酸中，浓度为 1 mg/mL。将溶液在 2-8 °C 下孵育过夜或在室温下孵育 1-3 小时或直至完全溶解。
   3. 准备 1 mL 胶原蛋白 IV:纤连蛋白混合物（320 μL 胶原蛋白 IV、80 μL 纤连蛋白、600 μL 无菌双蒸 H 2 O）。混合物可以储存在 -20 °C 下。
5. 用 ECM 涂布芯片
   1. 从两个通道中完全吸出冷 DPBS。将 P200 移液器设置为吸收 100 μL 胶原蛋白 IV:纤连蛋白溶液。
   2. 通过底部通道入口引入溶液，直到出口处形成小液滴。取下移液器吸头后，在入口上留下一个小液滴。
   通过
   3. 顶部通道入口引入层粘连蛋白溶液，直到在出口处形成小液滴。取下移液器吸头后，在入口上留下一个小液滴。
   4. 仔细查看通道以确保不存在气泡。如果存在气泡，请用适当的 ECM 溶液清洗通道，直到去除所有气泡。
   5. 对每个色片重复步骤 5.5.1–5.5.4。
   6. 将 1.5 mL DPBS 添加到 15 mL 锥形管的盖子中。将 DPBS 盖与芯片一起放入 150 mm 培养皿中，以提供额外的湿度并用封口膜密封培养皿。为获得最佳结果，请将芯片在 4 °C 下孵育过夜><。 注意:如果需要，可以在芯片激活和 ECM 包被的同一天接种细胞，但最好是过夜孵育。加入 ECM 并在 37 °C 下孵育芯片后 4 小时即可接种芯片。

6. 播种"大脑侧"通道并将 EZ 球体分化为混合神经培养物

1. 将装有准备好的薯片的培养皿带到 BSC。用 200 μL NDM 轻轻洗涤两个通道。
2. 避免接触端口，小心地从芯片表面吸出多余的介质液滴。在接种每个芯片之前轻轻搅拌细胞悬液，以确保细胞悬液均匀
3. 将 iNPC 植入顶部通道以生成"brain side"
   1. 将细胞 （1 x 106 个细胞/mL） 接种到芯片的顶部通道中。将含有 30–100 μL 细胞悬液的 P200 吸头添加到顶部通道入口处，然后轻轻地将吸头从移液器中释放。取空的 P200 移液器，按下柱塞，将其插入顶部通道出口，然后小心地将单细胞悬液拉过芯片。
   2. 盖上培养皿并转移到显微镜中，以检查顶部通道内细胞的接种密度和均匀分布。从芯片入口和出口端口轻轻取下移液器吸头。
   3. 种子密度应显示为 20% 覆盖率。如果接种密度高于或低于预期或不均匀，请将芯片放回 BSC，用 200 μL 新鲜培养基洗涤通道 2 次，然后重复步骤 6.3.1。
   4. 确认正确的细胞密度后，在接种每批芯片后，立即将芯片在 37 °C 的培养箱中放置 2 小时。用新鲜的 NDM 洗掉不附着的细胞。
   5. 在开始流式之前，将细胞保持在 37 °C 的静态条件下，每天更换 NDM 至少 48 小时。iBMEC 可以在 iNPC 附着后或 iNPC 接种后的第二天接种。

7. 将 iBMEC 植入底部通道以生成"血液侧"

1. 将装有准备好的薯片的培养皿带到 BSC。用 200 μL EC 培养基轻轻清洗底部通道。
2. 避免接触端口，小心地从芯片表面吸出过量 EC 介质的液滴，确保将介质留在两个通道中。在接种每个芯片之前轻轻搅拌细胞悬液，以确保细胞悬液均匀。
3. 使用 P200 移液器，吸取 30–100 μL iBMEC 细胞悬液（14–20 x 10⁶ 个细胞/mL），并将吸头放入底部通道入口。轻轻断开吸头与移液器的连接，将含细胞的吸头留在进样口。
4. 用空吸头按下 P200 移液器上的柱塞，插入底部通道出口，然后通过缓慢释放移液器柱塞，小心地将单细胞悬液拉过底部通道。
5. 从芯片表面吸出多余的细胞悬液。避免直接接触入口和出口，以确保没有细胞悬液从通道中吸出。
6. 盖上芯片并将其转移到显微镜上以观察接种密度。在显微镜下以 4 倍或 10 倍观察时，底部通道应填充细胞之间没有可观察到的间隙（图 3）。
7. 如果接种密度低于 90% 覆盖度或分布不均匀，请相应地调整细胞密度并重复步骤 7.2-7.6，直到在通道内达到正确的密度。确认正确的细胞密度后（图 3），将细胞接种到剩余的芯片中。要将细胞附着在位于底部通道顶部的多孔膜上，请将每个芯片倒置并放在芯片支架中。
8. 在 150 mm 培养皿内放置一个小储液槽（15 mL 锥形管盖，含有无菌 DPBS），为细胞提供湿度。将芯片在 37 °C 下孵育约 3 小时，或直到底部通道中的细胞附着。一旦 iBMEC 附着（接种后 ~3 小时），将芯片翻转回直立位置，以允许细胞附着在底部通道的底部。

8. 心流的启动

1. 通常在 iBMEC 接种后 48 小时开始流速。这段时间是 iBMEC 牢固地连接到芯片所必需的。
2. 为了保持流经芯片的层流，对介质进行脱气和平衡温度非常重要。培养基必须在 37 °C 水浴中预热 1 小时。
3. 通过在真空驱动过滤系统下孵育 15 分钟，最多可对 50 mL 的加热培养基进行脱气。
4. 便携式模块的灌注
   1. 用 70% 乙醇对便携式模块包装和托盘的外部进行消毒，擦拭并转移到 BSC 中。打开包装并将模块放入托盘中。将它们与储液槽朝向托盘的背面。
   2. 将 3 mL 预平衡的温介质移液至每个进样口储液槽中。将 EC 培养基添加到底部通道的入口容器中，将 NDM 添加到顶部通道的顶部通道入口容器中（图 4）。
   3. 将 300 μL 预平衡的温介质移液到每个出口储液器中，直接位于每个出口端口上方（图 4）。
   4. 每个托盘上最多放置 6 个便携式模块。将托盘带到培养箱中，将其完全滑入培养模块，托盘手柄朝外。
   5. 在培养模块上选择并运行 "Prime" 循环。关闭培养箱门，让培养模块灌注便携式模块（需要 ~1 分钟）。当状态栏显示 "Ready" 时，启动周期完成。从培养模块中取出托盘并将其带到 BSC。
   6. 通过检查 BSC 中每个便携式模块的底面，验证便携式模块是否已成功灌注。查找所有四个端口处是否存在小液滴。
      1. 如果任何便携式模块没有显示液滴，请在这些模块上重新运行 prime cycle。如果任何介质滴到托盘上（出口端口可能会更频繁地发生这种情况），请用 70% 乙醇清洁托盘。
5. 将芯片连接到便携式模块、调节和启动流程
   1. 用温暖、平衡的细胞特异性培养基轻轻洗涤每个芯片的两个通道，以去除通道中任何可能的气泡，并将小液滴培养基（根据通道中的介质）放在每个入口和出口的顶部。
   2. 将带有托架的芯片插入便携式模块，每个托盘上最多放置 6 个芯片。将托盘插入培养模块。在培养模块上对适当的器官芯片培养条件（流速和拉伸）进行编程。
   3. 一旦"调节"循环完成，编程条件将立即开始。
      注意:每个通道的流速可以独立控制，并且可以设置为 0–1,000 μL/h 的流速范围。BBB 芯片通常以 30 μL/h 的速度培养。当以 30 μL/h 和 1000 μL/h 的速度流动 EC 介质或 ESM 等介质时，剪切力分别为 0.01 dyn/cm² 和 0.33 dyn/cm²。
   4. 运行"调节"循环，大约需要 2 小时，之后培养模块将在预设的器官芯片培养条件下开始流动。

结果

图 1: 芯片载体中芯片的顶视图示意图，带有标记的端口。

图 2:基于 iPSC 的 BBB 芯片制备和工作流程的流程图。 在开始工作流程之前，需要从 iPSC 中预先分化神经细胞和内皮细胞。

图 3:iBMEC 在底部通...

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