利用iPSC来源的前体细胞生成血脑屏障芯片

摘要

来源：Jagadeesan, S.，等，人源iPSC衍生的血脑屏障芯片的构建。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了利用iPSC来源的前体细胞构建血脑屏障芯片的方法。该方法包括将神经前体细胞和脑微血管内皮细胞分别接种在具有多孔膜的独立通道中。通过灌注分化培养基，内皮细胞形成类似血管的紧密连接，神经细胞则分化成熟为多种脑细胞类型，从而在芯片上建立功能性的血脑屏障。

方案

1. 诱导多能干细胞来源的神经前体细胞（iNPCs）的生成

1. 按照下述方法并参照先前已发表的方案，从iPSC集落生成EZ球体。
   1. 在已包被基底膜基质（0.5 mg/板）的6孔板中，使用mTESR1或其他商业培养基将iPSC集落培养至完全汇合（见材料表）。
   2. 移除iPSC培养基，加入2 mL EZ球体培养基 [ESM；DMEM:F12（7:3）添加100 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、100 ng/mL表皮生长因子、5 µg/mL肝素和2% B27添加剂]。
   3. 使用无菌1000 µL移液枪头背面或细胞刮刀轻轻刮取每个完全汇合孔的底部。
   4. 收集所有细胞，并将其转移至超低吸附T25培养瓶中，以促进自由漂浮球体的自发形成。于37 °C孵育过夜。
   5. 当培养基变黄时，每2–3天更换一次球体培养基，方法是更换一半体积的新鲜ESM。此操作可使球体保留在条件化培养基中，这对球体的生长和维持至关重要。
      1. 将培养瓶倾斜放置于试管架上，静置1–2分钟，使球体依靠重力自然沉降到培养瓶角落。
      2. 待球体沉降后，用5 mL或10 mL血清移液管吸除一半上清液，并补充等体积新鲜预温的ESM。
   6. 每周传代EZ球体，按先前所述方法将其切割为直径约200 μm的片段。....

结果

图1： 芯片在芯片载体中的顶视图示意图，标注了各端口。

图2：基于iPSC的血脑屏障芯片制备与工作流程图。在启动工作流程之前，需先将iPSCs预分化为神经细胞和内皮细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase	EMD Millipore	SCR005	解离溶液
B27	Gibco	12587010
Bfgf	Peprotech	100-18B
Chip-S1	Emulate Inc	Chip-S1	器官芯片
Collagen IV	Sigma	C5533
DMEM: F12	Thermo Fisher Scientific	31330038
Emulate Reagent 1 (ER-1)	Emulate Inc	ER-1
Emulate Reagent 2 (ER-2)	Emulate Inc	ER-2
Fibronectin	Sigma	F1141
Glutamax	Life Technologies	35050038	谷氨酰胺补充剂
hBDNF	Peprotech	450-02
KOSR	Thermo Fisher Scientific	10828028
Laminin	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	354234	基底膜基质
mTeSR1	StemCell Technologies, Inc.	85851
NEAA	Biological industries	01-340-1B
NutriStem	Biological industries	05-100-1A	替代培养基
血小板贫浆来源牛血清（PPP）	Biomedical Technologies	J64483AB
视黄酸（RA）	Sigma	R2625
Steriflip-GP 无菌离心管顶滤器	Millipore	SCGP00525
β-巯基乙醇	Life Technologies	31350010