利用iPSC来源的前体细胞生成血脑屏障芯片

摘要

来源：Jagadeesan, S.，等，人源iPSC衍生的血脑屏障芯片的构建。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了利用iPSC来源的前体细胞构建血脑屏障芯片的方法。该方法包括将神经前体细胞和脑微血管内皮细胞分别接种在具有多孔膜的独立通道中。通过灌注分化培养基，内皮细胞形成类似血管的紧密连接，神经细胞则分化成熟为多种脑细胞类型，从而在芯片上建立功能性的血脑屏障。

方案

1. 诱导多能干细胞来源的神经前体细胞（iNPCs）的生成

1. 按照下述方法并参照先前已发表的方案，从iPSC集落生成EZ球体。
   1. 在已包被基底膜基质（0.5 mg/板）的6孔板中，使用mTESR1或其他商业培养基将iPSC集落培养至完全汇合（见材料表）。
   2. 移除iPSC培养基，加入2 mL EZ球体培养基 [ESM；DMEM:F12（7:3）添加100 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、100 ng/mL表皮生长因子、5 µg/mL肝素和2% B27添加剂]。
   3. 使用无菌1000 µL移液枪头背面或细胞刮刀轻轻刮取每个完全汇合孔的底部。
   4. 收集所有细胞，并将其转移至超低吸附T25培养瓶中，以促进自由漂浮球体的自发形成。于37 °C孵育过夜。
   5. 当培养基变黄时，每2–3天更换一次球体培养基，方法是更换一半体积的新鲜ESM。此操作可使球体保留在条件化培养基中，这对球体的生长和维持至关重要。
      1. 将培养瓶倾斜放置于试管架上，静置1–2分钟，使球体依靠重力自然沉降到培养瓶角落。
      2. 待球体沉降后，用5 mL或10 mL血清移液管吸除一半上清液，并补充等体积新鲜预温的ESM。
   6. 每周传代EZ球体，按先前所述方法将其切割为直径约200 μm的片段。EZ球体可维持传代至多25代，最佳使用代次为第8至25代之间。
2. 制备iNPC的单细胞悬液：
   1. 为诱导神经分化，将EZ球体解离为单细胞。
   2. 从T75培养瓶中收集切割后3–4天的球体，转移至15 mL锥形管中，静置2分钟或直至所有球体完全沉降至管底。
   3. 使用5 mL移液管缓慢吸除ESM，避免扰动已沉降的球体。加入1 mL解离溶液（见材料表），于37 °C孵育10分钟。
   4. 孵育5分钟后轻轻摇动解离溶液与球体，确保所有沉降的球体均被充分处理。
   5. 缓慢吸除解离溶液，加入1 mL神经分化培养基 [NDM；DMEM:F12添加2%不含维生素A的B27添加剂、1% N2添加剂以及人源脑源性神经营养因子（hBDNF，20 ng/mL）]。
   6. 使用1 mL移液枪先吹打数次，再换用200 µL移液枪继续吹打，直至所有球体完全解离为单细胞。吹打过程中应避免产生气泡。
   7. 使用血细胞计数板对解离后的细胞进行计数，并将细胞稀释至终浓度为1 × 10⁶ 个细胞/mL。可根据具体实验需求调整细胞密度。
      注意：对于持续不超过3天的短期培养，建议使用较高密度（最高可达6 × 10⁶ 个细胞/mL）；而对于持续长达3周的长期应用，则建议使用较低密度。
      注意：细胞现已准备好接种至芯片的上层通道，以形成“脑侧”结构。

2. 将iPSC诱导分化为iBMEC

1. 以1:6的比例将一个6孔板中单层汇合的iPSC传代至经基底膜基质包被的6孔板中。让细胞贴壁24小时。每日更换iPSC培养基。
2. 使用血细胞计数板每日对细胞进行计数。
3. 当细胞密度达到 1.5–3.0 × 10⁵ 个细胞/孔时，将 iPSC 培养基更换为 3 mL 未条件化培养基，不含 bFGF [DMEM:F12 1:1，含 10% 去除血清替代物（KOSR）、1% 非必需氨基酸（NEAA）、0.5% 谷氨酰胺补充剂（材料表），以及 100 µM β-巯基乙醇]。每天更换培养基，持续 6 天。
4. 第6天，将培养基更换为内皮细胞（EC）培养基[人内皮无血清培养基（hESFM）添加1%血小板贫浆来源的牛血清、20 ng/mL bFGF和10 µM 全反式维甲酸（RA）]，继续培养2天。
5. 移除内皮细胞培养基，每孔加入1 mL解离溶液，37 °C孵育35分钟。
   注意： 尽管在此使用的解离溶液中该孵育时间相对较长，但iBMECs能够耐受此处理，细胞活力仍可保持在90%以上。
6. 通过轻柔吹打细胞悬液，将细胞从孔板中脱离，并收集全部细胞至15 mL锥形管中。
   注意： 避免剧烈吹打。若细胞不易脱落，可额外孵育5分钟。
7. 向15 mL离心管中加入1体积EC培养基以终止Accutase作用，200 × g离心5 min，弃去上清，更换为1 mL EC培养基（不含bFGF和RA）。
8. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞密度调整至 14–20 x 10⁶ 细胞/毫升
   注意： 细胞现已准备好接种至芯片的下层通道，以形成“血液侧”。

3. 器官芯片的微加工

1. 采用此前已建立的方法，使用器官芯片构建血脑屏障（BBB）芯片模型并进行制备。该高通道器官芯片（参见材料表）由高度柔韧的聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体加工而成，包含两个由柔性多孔膜分隔的重叠且平行的微尺度通道。上、下微通道的尺寸分别为 1 mm × 1 mm 和 1.0 mm × 0.2 mm。两个通道之间由一层厚 50 μm、含孔径 7 μm、孔间距 40 μm 的多孔 PDMS 柔性膜分隔。分隔通道的多孔膜表面积为 0.171 cm²。

4. 芯片制备

1. 器官芯片以预包装形式提供，置于芯片载体中，避免了操作过程中对芯片位置的干扰或错位。此外，芯片载体可牢固连接至便携式模块（“Pod”），作为培养模块与芯片之间的接口。
   1. 用70%乙醇喷洒芯片包装，并将其移入生物安全柜（BSC）中。
   2. 打开包装，将器官芯片放置于无菌培养皿中。仅通过载体两侧进行操作，避免直接接触芯片。
   3. 确保载体上的标签朝向右侧（图1）；若使用多个芯片，应使它们均保持相同方向排列。
   4. 在每个芯片载体的标签处进行标记（完整的芯片制备与操作流程见图2）。

5. 表面活化与细胞外基质包被

1. 表面活化溶液的制备
   1. 试剂瓶中提供的模拟试剂1（ER-1，每瓶含5 mg）对光敏感，需在使用前新鲜配制。ER-1的完整性对于芯片的成功制备至关重要。
   2. 操作ER-1时应关闭生物安全柜（BSC）内的照明。
      注意：ER-1具有眼部刺激性，必须在生物安全柜内佩戴适当的手套和眼部防护装备进行操作。
   3. 使用前将ER-1和ER-2试剂平衡至室温（RT）。
   4. 用铝箔包裹空的无菌15 mL锥形管，以保护溶液免受光照。
   5. 在生物安全柜内，轻轻敲击ER-1试剂瓶，使粉末沉降至瓶底。
   6. 向试剂瓶中加入1 mL ER-2缓冲液，并立即将其内容物转移至已包裹铝箔的15 mL锥形管底部。不要用移液器吹打混匀。转移至锥形管中的溶液呈红色。
   7. 重复步骤5.1.6共3次。最后一次操作时，盖紧ER-1试剂瓶并倒置，以收集瓶盖内残留的粉末，然后将溶液转移至锥形管中；最终总体积为4 mL ER-1溶液。
   8. 向15 mL锥形管中的4 mL ER-1溶液中加入6 mL ER-2溶液，使终浓度为0.5 mg/mL。ER-1应在ER-2溶液中完全溶解。
2. 表面活化
   1. 使用P200移液器和无菌200 μL滤芯吸头，吸取200 μL ER-1混合液。
   2. 将移液器插入底部入口，推动20 μL ER-1混合液通过底部通道，直至混合液开始从底部通道出口流出。
   3. 加入约50 μL ER-1混合液，并将其置于顶部通道入口。推动混合液通过顶部通道，直至其开始从顶部通道出口流出。
   4. 通过轻柔抽吸去除芯片表面多余的ER-1混合液。确保仅从芯片表面去除混合液，而通道内仍保留液体。
   5. 在紫外（UV）活化前确认通道内无气泡。若发现气泡，使用ER-1混合液冲洗通道以去除气泡。
   6. 将装有芯片的敞口培养皿放入Emulate公司提供的紫外光箱中。
   7. 将紫外光箱背面的开关设置为“Consistent”模式，打开电源并启动紫外活化。将芯片置于紫外光下照射20分钟。
      注意：避免人员暴露于紫外光下。
   8. 从两个通道中移除ER-1混合液。
   9. 用200 μL ER-2溶液冲洗每个通道。
   10. 从两个通道中移除ER-2溶液。
   11. 用200 μL无菌冷的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗每个通道。
   12. 将冷的DPBS保留在通道内，直至进行下一步操作。
3. 细胞外基质（ECM）的制备与包被
   1. 通过将各ECM组分与冷DPBS、水或其他溶剂混合，配制成最终工作浓度的ECM溶液。每次使用时均需新鲜配制。
   2. 根据拟接种细胞类型确定的组成，对芯片的顶部和底部通道均进行ECM包被。ECM混合液在使用前必须保持在冰上。
   3. 使用层粘连蛋白（50 µg/mL）包被“脑侧”，使用胶原蛋白IV与纤连蛋白按4:1比例混合（320:80 µg/mL）包被“血侧”，具体如第5.6节所述。
4. ECM分装液的制备
   1. 将1 mg/mL的层粘连蛋白用冷DPBS稀释至终浓度50 µg/mL。分装后于-20 °C保存备用。
   2. 将胶原蛋白IV溶于0.1%乙酸中，配制成1 mg/mL的溶液。将溶液在2–8 °C下孵育过夜，或在室温下孵育1–3小时，直至完全溶解。
   3. 配制1 mL胶原蛋白IV:纤连蛋白混合液（320 µL胶原蛋白IV，80 µL纤连蛋白，600 µL无菌双蒸H2O）。该混合液可于-20 °C保存。
5. 芯片的ECM包被
   1. 彻底抽吸两个通道中的冷DPBS。将P200移液器调至吸取100 μL胶原蛋白IV:纤连蛋白溶液。
   2. 通过底部通道入口加入溶液，直至出口处形成小液滴。移除吸头后，在入口处保留一小滴液体。
   3. 通过顶部通道入口加入层粘连蛋白溶液，直至出口处形成小液滴。移除吸头后，在入口处保留一小滴液体。
   4. 仔细观察通道，确保无气泡存在。如有气泡，使用相应的ECM溶液冲洗通道，直至所有气泡被清除。
   5. 对每一片芯片重复步骤5.5.1–5.5.4。
   6. 向15 mL锥形管盖内加入1.5 mL DPBS。将装有DPBS的管盖放入盛有芯片的150 mm培养皿中，以提供额外湿度，并用封口膜密封培养皿。为获得最佳效果，建议将芯片在4 °C孵育过夜。
      注意：如需要，可在芯片活化和ECM包被当天接种细胞，但推荐过夜孵育。若将芯片在37 °C孵育，加入ECM后4小时即可准备接种。

6. 在“脑侧”通道中接种并诱导EZ类脑体分化为混合神经元培养物

1. 将含有已制备芯片的培养皿移至生物安全柜中。用 200 µL NDM 轻柔冲洗两个通道。
2. 避免接触进样口，小心吸除芯片表面多余的培养基液滴。接种每个芯片前，轻柔振荡细胞悬液，以确保细胞悬液均匀。
3. 将iNPCs接种至顶部通道以构建“脑侧”
   1. 将细胞（1 × 10⁶ 个细胞/mL）接种到芯片的顶部通道中。将含有30–100 μL细胞悬液的P200吸头插入顶部通道入口，然后轻柔地从移液器上释放吸头。取一个空的P200移液器，按下活塞，将其插入顶部通道出口，然后小心地将单细胞悬液通过芯片。
   2. 盖上培养皿，转移至显微镜下检查顶部通道内细胞的接种密度和分布均匀性。轻柔地将移液器吸头从芯片的入口和出口移除。
   3. 接种密度应达到约20%的覆盖率。若接种密度高于或低于预期，或分布不均，需将芯片移回生物安全柜，用200 μL新鲜培养基清洗通道2次，并重复步骤6.3.1。
   4. 确认细胞密度正确后，立即在接种每批芯片后将芯片置于37 °C培养箱中孵育2小时。用新鲜NDM洗去未贴壁的细胞。
   5. 在启动灌流前，将细胞在37 °C下保持静态培养，并每天更换NDM，至少持续48小时。iBMECs可在iNPCs贴壁后或iNPCs接种后的次日接种。

7. 将iBMECs接种至底部通道以形成“血液侧”

1. 将含有已制备芯片的培养皿移至生物安全柜中。用 200 µL EC 培养基轻轻冲洗底部通道。
2. 避免接触进样口和出样口，小心吸除芯片表面多余的 EC 培养基液滴，确保两个通道内均保留培养基。接种每块芯片前，轻轻振荡细胞悬液，以保证细胞悬液均匀。
3. 使用 P200 移液器吸取 30–100 µL iBMEC 细胞悬液（14–20 × 10⁶ 个细胞/mL），并将枪头插入底部通道的入口。轻轻将含有细胞的枪头从移液器上取下，使其保留在进样口内。
4. 将一个空枪头装在 P200 移液器上，按下压杆，插入底部通道出口，然后通过缓慢释放移液器压杆，将单细胞悬液轻柔地抽吸穿过底部通道。
5. 吸除芯片表面多余的细胞悬液。避免直接接触进样口和出样口，以防止将通道内的细胞悬液吸出。
6. 盖上芯片并转移至显微镜下观察接种密度。在显微镜 4× 或 10× 下观察时，底部通道应被细胞完全填充，细胞之间无可见间隙（图 3）。
7. 若接种密度低于 90% 覆盖率或分布不均，应相应调整细胞密度，并重复步骤 7.2–7.6，直至通道内达到理想密度。确认细胞密度合适后（图 3），对剩余芯片进行细胞接种。为使细胞附着于位于底部通道上方的多孔膜上，将每块芯片倒置并置于芯片支架中。
8. 在 150 mm 培养皿内放置一个小储液槽（含无菌 DPBS 的 15 mL 离心管盖），以提供细胞所需的湿度。将芯片置于 37 °C 培养箱中孵育约 3 小时，或直至底部通道内的细胞完全贴壁。iBMEC 贴壁后（接种后约 3 小时），将芯片翻转回直立位置，使细胞能够附着于底部通道的底部区域。

8. 启动流体流动

1. 通常在iBMECs接种后48小时启动灌注。此时间段对于iBMECs牢固附着于芯片是必需的。
2. 为维持芯片内的层流，重要的是对培养基进行脱气并平衡其温度。培养基必须在37 °C水浴中预热1小时。
3. 最多50 mL的预热培养基可在真空驱动的过滤系统下孵育15分钟以完成脱气。
4. 便携式模块的预启动
   1. 用70%乙醇对便携式模块包装和托盘的外表面进行消毒，擦拭后转移至生物安全柜（BSC）中。打开包装，将模块放入托盘内，并使其储液槽朝向托盘后方。
   2. 向每个入口储液槽中加入3 mL已预平衡的温热培养基。将内皮细胞（EC）培养基加入底部通道的入口储液槽，将NDM加入顶部通道的入口储液槽（图4）。
   3. 向每个出口储液槽（直接位于各出口端口上方）加入300 μL已预平衡的温热培养基（图4）。
   4. 每个托盘最多可放置六个便携式模块。将托盘移至培养箱中，并完全滑入培养模块，确保托盘手柄朝外。
   5. 在培养模块上选择并运行“预启动”（Prime）循环。关闭培养箱门，使培养模块对便携式模块进行预启动（约需1分钟）。当状态栏显示“就绪”（Ready）时，表示预启动循环完成。将托盘从培养模块中取出，并移回生物安全柜（BSC）。
   6. 在生物安全柜（BSC）中检查每个便携式模块的底面，确认其是否成功完成预启动。观察四个端口处是否存在微小液滴。
      1. 若任一便携式模块未出现液滴，则需对该模块重新运行预启动循环。若培养基滴落至托盘表面（此情况在出口端口处更常见），应用70%乙醇清洁托盘。
5. 芯片与便携式模块的连接、调节及流动启动
   1. 用温热且已平衡的细胞特异性培养基轻轻冲洗每个芯片的两个通道，以去除通道中可能存在的气泡，并在每个入口和出口端口顶部滴加少量培养基（根据通道内培养基类型选择相应培养基）。
   2. 将带有载体的芯片插入便携式模块中，每个托盘最多放置六个。将托盘插入培养模块。在培养模块上设定相应的器官芯片培养条件（流速和拉伸）。
   3. 当“调节”（Regulate）循环完成后，设定的培养条件将立即开始执行。
      注意：两个通道的流速可独立控制，设定范围为0–1,000 µL/h。血脑屏障（BBB）芯片通常在30 µL/h条件下培养。当EC培养基或ESM分别以30 µL/h和1000 µL/h流速灌注时，所产生的剪切力分别为0.01 dyn/cm²和0.33 dyn/cm²。
   4. 运行“调节”循环，该过程约需2小时，之后培养模块将在预设的器官芯片培养条件下开始流动。

结果

图1： 芯片在芯片载体中的顶视图示意图，标注了各端口。

图2：基于iPSC的血脑屏障芯片制备与工作流程图。在启动工作流程之前，需先将iPSCs预分化为神经细胞和内皮细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase	EMD Millipore	SCR005	解离溶液
B27	Gibco	12587010
Bfgf	Peprotech	100-18B
Chip-S1	Emulate Inc	Chip-S1	器官芯片
Collagen IV	Sigma	C5533
DMEM: F12	Thermo Fisher Scientific	31330038
Emulate Reagent 1 (ER-1)	Emulate Inc	ER-1
Emulate Reagent 2 (ER-2)	Emulate Inc	ER-2
Fibronectin	Sigma	F1141
Glutamax	Life Technologies	35050038	谷氨酰胺补充剂
hBDNF	Peprotech	450-02
KOSR	Thermo Fisher Scientific	10828028
Laminin	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	354234	基底膜基质
mTeSR1	StemCell Technologies, Inc.	85851
NEAA	Biological industries	01-340-1B
NutriStem	Biological industries	05-100-1A	替代培养基
血小板贫浆来源牛血清（PPP）	Biomedical Technologies	J64483AB
视黄酸（RA）	Sigma	R2625
Steriflip-GP 无菌离心管顶滤器	Millipore	SCGP00525
β-巯基乙醇	Life Technologies	31350010