从小鼠胚胎背外侧端脑中分离与培养细胞

摘要

来源：Landeira, B. S.，等。利用二维培养系统对大脑皮层原代细胞进行活体成像。J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了一种从小鼠胚胎端脑背外侧区域分离和培养原代大脑皮层细胞的实验方案。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 动物医学评审委员会的审核。

1. 背外侧端脑显微解剖

1. 准备解剖液（100 mL）：98.5 mL 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS），0.5 mL 的 5 M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）pH 7.4，1 mL 青霉素/链霉素（10,000 单位/mL 和 10,000 µg/mL）。
2. 对解剖液进行滤膜除菌。
3. 在异氟烷麻醉下，从怀孕的 C57/Bl6 小鼠（Mus musculus）中取出胚胎发育第14天（E14）的胚胎。
   注意：以检测到阴道栓的当天为 E0。从怀孕小鼠体内取出胚胎后，解剖操作应在 1 小时内完成。本方案同样适用于 E11 至 E17 的胚胎。
4. 在无菌条件下通过子宫切除术取出胚胎。
5. 将胚胎转移至含有冷解剖液（4 °C）的培养皿中。
6. 沿大脑纵裂剪开，从颅骨中取出脑组织。通常每次实验可获得 5 至 10 个胚胎。每个 E14 胚胎脑组织可获得约 2 × 10⁶ 个细胞，包括前体细胞和终末分裂后神经元（比例约为 1:1）。
   注意：后续步骤请使用体视显微镜操作。
7. 使用解剖镊去除脑膜。从中间切开端脑以分离左右半球。使用解剖镊沿背内侧曲线及皮层-亚皮层边界剪切，以分离背外侧端脑。将分离出的背外侧端脑转移至含有冷解剖液（4 °C）的 2 mL 离心管中，待所有脑组织解剖完成后统一处理。

2. 细胞解离与接种

1. 准备增殖培养基（50 mL DMEM+10% FCS）：44 mL 达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）、5 mL 胎牛血清（FCS）、0.5 mL 40% 葡萄糖、0.5 mL 青霉素/链霉素（10,000 单位/mL 和 10,000 µg/mL）。用滤器对增殖培养基进行过滤灭菌。
2. 准备分化培养基（50 mL DMEM + 2% B27）：48 mL DMEM、1 mL B27、0.5 mL 40% 葡萄糖、0.5 mL 青霉素/链霉素（10,000 单位/mL 和 10,000 µg/mL）。用滤器对分化培养基进行过滤灭菌。
3. 从 E14 小鼠中分离出背外侧端脑组织后，将收集的组织与冷解剖液一同离心（4 °C，340 × g，5 分钟），使组织沉淀。
4. 用移液器吸除上清液，加入 1 mL 预热（37 °C）的 0.05% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）进行化学消化。37 °C 孵育 15 分钟。加入 2 mL 增殖培养基以终止胰蛋白酶活性。
5. 将玻璃巴斯德移液管的管口在煤气灯或本生灯上灼烧数秒，使开口略微缩小。通过吸取 FCS 润洗移液管以涂覆管尖。为避免产生气泡，使用经火焰抛光并涂有 FCS 的巴斯德移液管对细胞进行机械性解离。
6. 离心细胞（4 °C，340 × g，5 分钟）。用移液器吸除上清液。加入 1 mL 增殖培养基，用移液器重悬细胞。重复此步骤一次。
7. 用 0.4% 台盼蓝溶液将细胞悬液稀释至 1:1。死细胞将被染成蓝色。使用纽鲍尔计数板计数活细胞数量（未染色细胞）。
8. 将细胞用增殖培养基稀释至 10⁶ 个细胞/mL。向每孔 24 孔组织培养板中加入 500 µL 细胞悬液（约 2.5 × 10⁵ 个细胞/cm²）。将细胞在 37 °C 和 5% CO² 条件下孵育。
   注意：请勿使用玻璃盖玻片，因其在实验过程中可能发生移动，从而改变观察视野。可选用玻璃底组织培养板作为替代。
   注意：若未使用经细胞培养处理的多孔板，务必在使用前用聚-D-赖氨酸（PDL，50 µg/mL）在 37 °C 预处理 2 小时。PDL 处理后的培养板经蒸馏水洗涤后可在 4 °C 保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)	Invitrogen Life Technologies	14175129
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-25G
青霉素/链霉素	Gibco	15140122
杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)	Gibco	12400-024
胎牛血清 (FCS)	Gibco	10437028
葡萄糖	Gibco	A2494001
B27	Gibco	17504044
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054
细胞观察显微镜	Zeiss