建立大鼠脊柱背根神经节原代细胞培养

摘要

来源：Lin, Y., 等 背根神经节的分离与原代培养以研究神经递质释放。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了一种从大鼠脊柱分离和培养背根神经节（DRG）细胞的技术。从脊柱中切除的DRG经酶处理并机械解离，以获得单细胞悬液。细胞在含有抑制剂和生长因子的培养基中培养，这些成分分别用于限制胶质细胞增殖并促进神经元生长。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 采集实验大鼠腰段背根神经节

1. 使用2至3周龄的Sprague-Dawley（SD）大鼠进行腰段背根神经节（DRG）的采集。
   注意：4周龄以上大鼠采集的DRG神经元在本文所述的培养条件下生长不良。
2. 将所有手术器械在高压灭菌器中灭菌。
3. 使用替来他明与唑拉西泮1:1混合液（20 mg/kg，腹腔注射）对大鼠进行麻醉，并等待其在脚趾夹捏试验中不再出现足部回缩反应。
   注意：本方案中可成功使用不同的麻醉策略。
4. 使用商用断头器对大鼠实施断头处死。
5. 使用断头器将大鼠躯干从前肢至股骨之间部分分离。采集区域示意图见图1A。
   注意：尾侧切割线应位于股骨稍前方。若脊柱切割位置过高，将导致腰段L6背根神经节被切除。
6. 沿胸骨纵向剪开，并使用解剖剪去除所有器官/组织（图2A-a）。
7. 沿躯干侧面剪开以获取大鼠背部组织，并去除皮肤。解剖后背部躯干的实物图见图1B。
8. 在采集DRG前将组织置于冰上预处理。操....

结果

图 1：组织处理示意图。腰段背根神经节（DRG）取自 3 周龄大鼠。(A) 虚线标示出使用剪刀切断动物身体的位置。(B) 去除皮肤后的背部躯干，以及(C) 腰段 DRG（L1-L6）的位置。插图显示了 DRG 及其连接的纤维（箭头所示）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
替来他明与唑拉西泮混合物（Zoletil）	Virbac	Zoletil 50	麻醉剂
胎牛血清	Biological Industries	04-001-1	培养基
丙酮酸钠	Sigma	S8636	培养基
青霉素/链霉素	Biological Industries	03-033-1	培养基
DMEM-F12	Invitrogen	12400024	培养基
聚-L-赖氨酸	Sigma	P9011	包被培养皿
胶原酶 IA	Sigma	9001-12-1	酶消化
Hank's 平衡盐溶液	Invitrogen	14170-112	培养基
胰蛋白酶 EDTA	Biological Industries	03-051-5	酶消化
巴斯德吸管	Hilgenberg	3150102	细胞吹打
阿糖胞苷（Ara-C）	Sigma	C6645	培养基
NGF	Millipore	NC011	培养基