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所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
注意：细胞培养溶液应在生物安全柜中使用无菌操作技术制备，并通过0.2 µm滤膜过滤，以防止污染。
1. 溶液与培养基的准备
- 将20 µL浓度为1 mg/mL的层粘连蛋白储备液稀释至2 mL无菌蒸馏水中，制备层粘连蛋白包被溶液2O. 在解剖当天制备。
- 配制10%马血清（ES）终止液：将5 mL马血清加入45 mL 1×Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，混匀。使用0.2 µm滤器系统或注射器滤头进行无菌过滤。4 °C保存。
- 配制4%牛血清白蛋白（BSA）储存液：将2 g BSA粉末加入1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，定容至终体积45 mL。使用0.2 µm滤器系统或注射器滤头进行无菌过滤。4 °C保存。
- 将木瓜蛋白酶稀释于1×HBSS中，配制成3 mg/mL的木瓜蛋白酶储备液。使用0.2 µm滤器系统或注射器滤头进行无菌过滤。于-20 °C保存。
- 将20 mg脱氧核糖核酸酶（DNase）粉末加入无菌H2O，并定容至终体积20 mL。使用0.2 µm滤器系统或注射器滤头进行无菌过滤。于-20 °C保存。
- 将352 mg抗坏血酸加入无菌蒸馏H2O中，定容至20 mL，配制抗坏血酸储备液。如需要，可在37 °C水浴中加热以促进溶解。使用0.2 µm滤器系统或注射器滤头进行无菌过滤。于-20 °C保存。
- 通过向50 mL Neurobasal培养基中加入以下成分来制备细胞培养基：500 µL Glutamax（100倍）、500 µL 马血清、1 mL B-27、100 µL 抗坏血酸、500 µL 青霉素-链霉素、50 µL 卡那霉素和50 µL 氨苄青霉素。使用0.2 µm滤器系统进行无菌过滤。4 °C保存。
- 将1 mL Triton X-100加入9 mL 1x PBS中，配制10%溶液，再稀释至0.01% Triton X-100溶液。由于Triton X-100具有黏性，移液时应缓慢操作，确保吸头完全充满液体。如有需要，可在37 °C水浴中加热以促进溶解。4 °C保存。
- 将10% Triton X-100母液稀释至0.01%，需进行三次连续的1:10稀释。取1 mL 10%母液加入9 mL 1×PBS中，配制成1%溶液；取1 mL 1%溶液加入9 mL 1×PBS中，配制成0.1%溶液；取1 mL 0.1%溶液加入9 mL 1×PBS中，配制成0.01%溶液。
- 通过将1 mL正常山羊血清（NGS）加入9 mL 1×PBS中配制10% NGS溶液，将100 µL NGS加入9.9 mL 1×PBS中配制1% NGS溶液。
- 配制谷氨酸储备液（100 mM），将735 mg L(+)-谷氨酸溶于无菌蒸馏水，并定容至50 mL。该浓度下溶解度较低，可加入少量（100 µL）1 M盐酸以提高溶解度。
- 通过将50 mg NBQX加入无菌蒸馏H₂O中，配制NBQX储备液（10 mM）2O 并定容至最终体积为 13 mL。
2. 培养皿和盖玻片的准备（在解剖前一天完成）
注意：我们发现，联合使用三种包被试剂——聚-L-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白，可实现理想的细胞黏附性和存活率。
- 在生物安全柜中放置10个35 mm的培养皿。每个培养皿中放入两个12 mm的圆形盖玻片，并加入70%乙醇浸泡10分钟。使用真空管线吸除各培养皿中残留的乙醇，使其完全挥发。
- 用移液器将约90–100 µL的0.1%多聚-L-赖氨酸溶液滴加到每个盖玻片上，确保盖玻片表面完全覆盖。盖上培养皿盖，置于37 °C培养箱中孵育1小时。
- 吸除各盖玻片上残留的多聚-L-赖氨酸溶液，并用无菌H2O冲洗。
- 用0.1%多聚-L-鸟氨酸溶液重复步骤2.2–2.3。
- 再用0.01%层粘连蛋白溶液重复步骤2.2–2.3。将培养皿置于37 °C/5% CO2培养箱中，直至次日进行细胞接种。
3. 小鼠胚胎解剖
注意：每个培养使用4至6只定时交配的怀孕小鼠。尽管大部分解剖过程在生物安全柜外进行，但仍需保持无菌操作。在解剖显微镜周围表面及手术器械上大量使用70%乙醇是理想的做法。解剖过程中也可佩戴口罩，以进一步防止污染。此外，我们在培养基中使用了4种不同的抗生素，因此污染的可能性较低。然而，如果使用抗生素存在问题，可将此解剖装置移至无菌操作台内进行。为保持细胞活性，所有解剖用溶液均应在4 ˚C预冷，并尽快完成解剖操作。我们不在冰上进行解剖。小鼠胚胎中脑神经元的解剖方法与先前报道的方法相同。
- 在解剖显微镜附近的实验台上准备一个区域，放置吸水垫，并用70%乙醇充分喷洒消毒。
- 用70%乙醇喷洒两个100 × 15 mm玻璃培养皿和一个50 × 10 mm玻璃培养皿，待乙醇完全挥发。挥发后，向每个100 × 15 mm培养皿中加入50 mL无菌1×HBSS。
- 将手术剪刀、镊子和切片刀片浸入70%乙醇中至少10分钟以进行灭菌。将器械取出后置于吸水垫上晾干。
- 采用CO2麻醉后行颈椎脱位法，处死妊娠时间明确的14天胚胎期（E14）、年龄为2–3个月的小鼠。
- 用70%乙醇喷洒已处死小鼠的腹部。用镊子夹住下腹部，使用手术剪刀切开腹腔。从镊子夹持处开始剪切，向两侧横向剪开，直至腹壁可向后翻折，使子宫清晰可见。
- 使用手术剪刀剪断子宫角的两端，取出子宫并放入盛有1×HBSS的培养皿中。
- 使用直头镊子小心地将胚胎从子宫中取出。整个操作过程中保持胚胎浸没在HBSS中。使用镊子或切片刀片迅速在颈部附近切断胚胎头部，尽量使切口平整。
- 在解剖显微镜下，将一个胚胎头部转移至干燥的50 mm培养皿中，腹侧朝上放置。用镊子夹住眼睛/吻部附近区域以固定头部，镊子应向下倾斜约45°，避免刺入中脑。
- 用另一只手操作镊子，小心去除中脑明显脊状隆起前方的透明皮肤层和颅骨。从正中线附近开始，向尾侧剥离皮肤和颅骨，直至中脑完全暴露。
- 将镊子垂直于暴露的中脑，一只镊尖置于皮层与中脑之间，另一只靠近小脑区域。向下按压并合拢镊子，完整取出中脑组织。中脑片段厚度约为0.5 mm。将取出的中脑片段放入第二个盛有新鲜1×HBSS的培养皿中。对每个胚胎重复此操作。
- 在解剖显微镜下，将脑组织片段腹侧朝上放置。若脑膜仍附着，用镊子轻轻夹住脑膜并将其从脑组织上提起并剥离去除。
- 脑组织片段应可见四个明显的象限。将片段摆放成两个较小的上部象限位于两个较大下部象限的上方。上部两个（较小）象限与下部两个（较大）象限之间有一明显的脊状分界。
- 用镊子夹住并分离上部象限与下部象限，弃去上部象限。剩余的下部象限在背侧外侧会有多余组织，该组织透明度低于剩余的腹侧组织。去除密度较低的背侧组织并弃去。最终保留的组织片段应包含黑质致密部（SNc）和腹侧被盖区（VTA）。
- 用镊子将剩余的腹侧组织片段切成4个小块，使用1 mL宽口移液器将其转移至含有1×HBSS的15 mL锥形管中。整个操作过程中，将装有脑组织片段的锥形管置于冰上保存。
- 对所有剩余的脑组织片段重复上述操作。
4. 细胞解离
- 细胞的酶消化
- 小心吸除含有中脑节段的15 mL锥形管中的HBSS，使节段留在管底。
- 向管中加入约800 µL木瓜蛋白酶溶液，置于37 °C培养箱中孵育7分钟。轻弹管壁重悬细胞，再放回37 °C培养箱继续孵育7分钟。
- 使用宽口1 mL移液枪头，仅将中脑节段转移至含有1 mL DNase的等分试样中。让节段沉降至等分试样底部，或暴露约1分钟。
- 使用宽口1 mL移液枪头，仅将中脑节段转移至含有2 mL终止液的15 mL锥形管中。待节段沉降至管底后，再在另一装有终止液的锥形管中重复清洗一次。
- 细胞悬液的机械吹打
- 在第二次终止液清洗管中，使用宽口1 mL移液枪头将细胞上下吹打10次，直至肉眼不可见大块组织片段。注意避免过度吹打，以尽量减少细胞裂解。
- 缓慢将300 µL的4% BSA溶液沿含有脑节段的15 mL锥形管管壁加入管底，小心取出移液枪头以维持悬液分层。在0.4 x g 条件下离心3分钟，随后小心吸除上清液，并将细胞重悬于400 µL细胞培养基中。
5. 细胞接种
注意：根据经验，每个胚胎可收集约 100,000 个活细胞。2 至 3 月龄的定时交配孕鼠通常每窝产仔 8 至 10 个胚胎；因此，每只定时交配孕鼠的细胞总收获量粗略估计约为 100 万个细胞。
- 使用血细胞计数板进行细胞计数，然后用细胞培养基将细胞悬液稀释至 2,000 个细胞/µL。轻轻吹打混匀。
- 从培养箱中取出步骤 2 中含有层粘连蛋白溶液的盖玻片，用真空泵吸除包被后的盖玻片上残留的层粘连蛋白溶液。尽快接种细胞，以防止盖玻片完全干燥。每张盖玻片上加入 100 µL 细胞悬液（含 2.0 × 105 个细胞），并将培养皿放入 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。
- 小心地向每皿中加入 3 mL 细胞培养基，然后放回 37 °C 培养箱中。每周进行两次半量换液，持续 2 周。
6. 在体外培养第14天使用腺相关病毒（AAV）载体感染细胞
- 每皿准备 1 mL 无血清 DMEM 培养基，加入 1 µL hSyn-GCaMP6f AAV（滴度为 1.0 × 1013）
- 吸除各皿中的细胞培养基，替换为含 hSyn-GCaMP6f 的 1 mL 无血清 DMEM 培养基，然后将培养皿放回 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。
- 吸除含 AAV 的无血清培养基，替换为 3 mL 细胞培养基，并将培养皿放回 37 °C 培养箱中。我们发现，AAV 感染 5–7 天可实现理想的 GCaMP 表达水平。在此病毒感染期间，需每隔 2–3 天更换一次培养基。
7. 19-21 天体外培养期间的活细胞共聚焦 Ca2+ 成像
- 记录缓冲液的配制
- 配制1 L HEPES记录缓冲液：将9.009 g NaCl、0.3728 g KCl、0.901 g D-葡萄糖、2.381 g HEPES、2 mL 1 M CaCl2储备液和500 µL 1 M MgCl2储备液加入800 mL无菌蒸馏H2O中。用NaOH调节pH至7.4，定容至1 L。
- 配制200 mL 20 µM谷氨酸记录缓冲液：将40 µL 100 mM谷氨酸储备液加入上述200 mL HEPES记录缓冲液中稀释。
- 配制200 mL 10 µM NBQX记录缓冲液：将200 µL 10 mM NBQX储备液加入200 mL HEPES记录缓冲液中稀释。
- 共聚焦成像
- 向无菌35 mm培养皿中加入3 mL记录缓冲液。
- 从37 °C培养箱中取出含有感染细胞的35 mm培养皿。使用尖头镊子小心夹住盖玻片边缘，迅速将其转移至盛有记录缓冲液的培养皿中。将剩余盖玻片连同培养基放回37 °C培养箱中继续孵育。将盛有记录缓冲液的培养皿运送至共聚焦显微镜。
- 启动成像软件。在软件初始化过程中进行下一步操作。
- 启动蠕动泵，并将管路插入记录缓冲液中。调节流速至2 mL/min。
- 将感染后的盖玻片从35 mm培养皿转移至记录浴槽中。
- 使用10倍水浸物镜和明场（BF）照明找到焦平面，并寻找神经元胞体密度较高的区域。切换至40倍水浸物镜，使用明场照明重新对焦样品。
- 在FluoView软件的“Dyes list”窗口中选择AlexaFluor 488并应用。
- AAV表达水平可能存在差异；因此，为避免荧光染料过度曝光和光漂白，应从较低的高压（HV）和激光功率设置开始。对于AlexaFluor 488通道，将高压（HV）设为500，增益设为1x，偏移设为0。对于488 nm激光线，将激光功率设为5%。为增加z轴方向的有效成像体积，将针孔尺寸增大至300 µm。使用“focus x2”扫描模式将发射信号最优调节至亚饱和水平。在此基础上进一步调整参数，直至各通道达到理想的可见度。
注意：为准确捕捉GCaMP检测到的完整Ca2+通量范围，需调整基础HV和激光功率设置，使荧光强度上升时不会导致探测器过饱和。
- 显微镜参数优化后，移动载物台以定位多个细胞表现出GCaMP6f荧光自发变化的区域，并对准所需成像的焦平面。
- 使用“Clip rect”工具将成像帧裁剪至每帧时间间隔略小于1秒的尺寸，以确保成像速率为每秒1帧。
- 将“Interval”窗口设置为1.0，“Num”窗口设置为600。
注意：为在指定时间点（300 s）准确递送不同记录缓冲液，必须校准泵的延迟时间，以确保新溶液能及时到达浴槽。该延迟取决于灌流速率（2 mL/min）以及用于输送溶液的管路长度。
- 为采集时间序列图像，选择“Time”选项，然后使用“XYt”扫描模式开始成像。
- 观察成像进度条，并在适当时间点将管路从HEPES记录缓冲液切换至20 µM谷氨酸记录缓冲液（例如，若泵的延迟校准为60 s，则应在第240帧时将管路切换至谷氨酸缓冲液，以确保在300 s时递送谷氨酸）。
- 成像完成后，点击Series Done按钮，保存完成的时间序列图像。继续用20 µM谷氨酸灌流5分钟，使培养的神经元总共暴露于谷氨酸10分钟。对每张待成像的盖玻片重复此过程。
- 在额外暴露于20 µM谷氨酸5分钟后，将盖玻片从浴槽中取出，并放回含有记录缓冲液的35 mm培养皿中，直至完成当天所有成像。