制备大鼠幼鼠脑的鼻周皮层-海马切片

摘要

来源：Valente, C. A., 等., 内嗅皮层-海马体脑片培养中的癫痫发生模型。J. Vis. Exp. (2021)

该视频展示了一种从幼鼠大脑中获取嗅周皮层-海马切片，并将其培养在含培养基的多孔板膜插件中的方法，以用于后续分析。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 鼻周皮层-海马切片的制备

注意：内嗅皮层-海马切片的制备使用P6-7天的Sprague-Dawley大鼠。

1. 培养设置与培养基制备
   1. 在培养前一天，准备好所需的培养基，并将其置于 4 °C 保存。
   2. 制备解剖用培养基：在 Gey's 平衡盐溶液（GBSS）中加入 25 mM 葡萄糖。
   3. 制备培养用培养基：50% Opti-MEM、25% HBSS、25% 马血清（HS）、25 mM 葡萄糖、30 µg/mL 庆大霉素。
   4. 制备维持培养基：Neurobasal-A（NBA）、2% B27、1 mM L-谷氨酰胺、30 µg/mL 庆大霉素，以及不同浓度的马血清（15%、10%、5% 和 0%）。
2. 脑组织获取
   1. 在开始培养前，使用 P1000 移液器向 6 孔板的每个孔中加入 1.1 mL 培养基，并将其置于 37 °C 环境中。
   2. 将所有设备（解剖显微镜、组织切片机、解剖灯、解剖工具、电极、培养板、插入式培养插件和滤纸）放入生物安全柜中，并在紫外线下灭菌 15 分钟。
   3. 将切片厚度调整为 350 µm。
   4. 从冰箱中取出 GBSS，向六个培养皿中各加入 5 mL GBSS。每只动物需要六个培养皿。
   5. 处死新生大鼠，使用锋利的剪刀在脑干基部进行断头。
   6. 用冷的 GBSS 将动物头部清洗三次，并将其移入安全柜内。
3. 组织分离与切片制备
   1. 用尖头镊子牢固插入眼眶以固定头部。
   2. 使用细剪刀从枕骨大孔开始沿中线向额叶方向剪开头皮/皮肤，并将其移开。
   3. 以相同方式剪开颅骨，并沿大脑横裂（大脑与小脑之间的间隙）剪开，使用弯曲长镊将其分开。
   4. 用刮匙弃去嗅球，将脑组织从头部取出，背侧朝上置于冰冻的 GBSS 中（图 1A）。
   5. 将细镊插入小脑，并沿中线使用刮匙小心地分开两侧半球（图 1B）。
   6. 使用短弯头镊子小心去除覆盖在海马上的多余组织，避免触碰海马结构。然后用刮匙在每个海马下方进行切割（图 1C）。
   7. 取一个半球，将海马朝上放置在滤纸上。重复操作处理另一侧半球，并将其平行放置于同一张滤纸上。将滤纸置于组织切片机上，使半球方向垂直于刀片，切成 350 μm 厚的切片（图 1D）。
   8. 将切好的组织放入盛有冷 GBSS 的培养皿中（图 1E）。
   9. 使用圆头电极小心分离切片（图 1F）。仅保留鼻周皮层和海马结构完整的切片。齿状回（DG）和 CA 区域应清晰可辨，内嗅皮层和外嗅皮层也应界限分明（图 1G）。
   10. 使用刮匙和圆头电极将每个切片转移至插入式培养插件上（图 1H-I）。用 P20 移液器吸除每个切片周围的多余解剖培养基（图 1J）。每个插入式培养插件可培养四个鼻周皮层-海马切片（图 1K）。
4. 培养维持
   1. 每隔一天更换一次培养基。
   2. 将培养基预热至 37 °C。
   3. 从培养箱中取出培养板，用镊子夹住插入式培养插件的塑料边缘将其取出（图 1L）。
   4. 用另一只手吸除孔中的旧培养基。将插入式培养插件放回原孔中，使用 P1000 移液器加入 1 mL 新鲜预热的培养基（图 1M）。对所有插入式培养插件重复此操作。确保膜与培养基之间无气泡残留。

结果

图 1：鼻周皮层-海马体器官型脑片制备的详细步骤。 （A）从头部取出脑组织，将其置于冰上预冷的GBSS中，背侧朝上。（B）将镊子插入小脑部位，沿中线打开脑组织，并去除海马体上方多余的组织。（C）用解剖刀在海马体下方进行切割，如箭头所示。（D）将两个海马体并列、腹面朝上放置于滤纸上，使用组织切片机切割成350 µm厚的切片。（E）将切好的海马体组织置于冰上预冷的GBSS中。（F）借助圆头玻璃电极分离各脑片。（G）仅选取显示完...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手术刀柄用刀片	Fine Science Tools	10011-00
脑组织/组织切片孵育系统	Warner Instruments
细胞培养插件，30 mm，亲水性聚四氟乙烯（PTFE）	Millipore SAS	PICM03050
常规培养箱	Thermo Scientific Heraeus	BB15, Function Line	设定为 37 °C 和 5% CO2
D-(+)-葡萄糖一水合物	Merck Millipore	1.08342.1000
D-(+)-葡萄糖溶液，45% 水溶液	Sigma	G8769
二水合磷酸氢二钠	Merck Milipore	1.06580.1000
Dumont #5 生物学级精细镊子，不锈钢	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5 标准镊子，不锈钢	Fine Science Tools	11251-20
Dumont #7 标准镊子，Dumoxel 材质	Fine Science Tools	11271-30
Dumont 医用 #7S 镊子，短弯头，不锈钢	Fine Science Tools	11273-22
庆大霉素储备液，50 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15750-037
Gey's 平衡盐溶液（GBSS）	Biological Industries	01-919-1A
玻璃电极	Science Products	GB150F-10	圆头，自制
巴斯德玻璃吸管，230 mm	VWR International	612-1702
马血清，热灭活（HS）	Thermo Fisher Scientific	26050-088
弯头虹膜刮匙	Fine Science Tools	10092-12
Labculture II 级生物安全柜	HERASafe	HS 12
L-谷氨酰胺溶液 200 mM（Q）	Thermo Fisher Scientific	25030-024
Neurobasal-A 培养基（NBA）	Thermo Fisher Scientific	10888-022
Opti-MEM® I 低血清培养基	Thermo Fisher Scientific	31985-047
铂金 5 刃刀片	Gillette
定性滤纸，纤维素，1 号，55 mm	Whatman	1001-055	中等保留能力，11 µm
定性滤纸，纤维素，1 号，90 mm	Whatman	1001-090	中等保留能力，11 µm
手术刀柄	Fine Science Tools	91003-12
经组织培养处理的无菌 6 孔板	Corning	CORN3516
温度控制器	MEDICAL SYSTEMS CORP.	TC-102
组织切片机	The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.	MTC/2	设定为 350 μm